受TGF-β/Smad4信号通路调控的miRNA在损伤骨骼肌纤维化中的功能研究

It has been shown that TGF-β/Smad pathway, playing a key role in the skeletal muscle fibrosis following injury, has a strong correlation with the expression and maturation of microRNA. However, there is little evidence about the miRNA regulated by TGF-β/Smad pathway during the fibrosis process and its function on the fibrosis of injured muscle. In this study, the target miRNA will be selected by the experiment in vitro and confirmed by the animal models. To investigate the function of miRNA, we will measure the fibrosis markers in C2C12 cells and in vivo using the mouse model of skeletal muscle fibrosis. Functional analysis of miRNA on muscle fibrosis will be demonstrated both in vitro and in vivo. Additionally, the direct targets of miRNA that mediate its effects remain to be identified and characterized for therapeutic purposes. Together, we propose that the effect of the miRNA regulated by TGF-β/Smad pathway on muscle fibrosis should be explored, and the molecular mechanism of the fibrosis during muscle injury should be further investigated. It is conceivable that modulation of miRNA regulated by TGF-β signaling could be a novel therapeutic strategy in the treatment of skeletal muscle fibrosis.

TGF-β/Smad信号通路在骨骼肌损伤后的纤维化进程中发挥关键作用，有研究表明Smad4与miRNA的表达和成熟有密切关联，然而是否存在相关miRNA受到TGF-β/Smad信号通路调控并参与损伤骨骼肌纤维化过程尚不明确。本研究拟利用体外细胞实验对miRNA进行筛选，通过对目标miRNA的干预，检测成肌细胞纤维化程度以锁定目标miRNA；并利用骨骼肌特异性敲除Smad4小鼠的钝挫伤模型，验证目标miRNA。进一步在细胞和体内验证目标miRNA对骨骼肌纤维化的影响，进而预测靶基因并验证其功能。本项目通过探索TGF-β/Smad信号通路调控的miRNA在损伤骨骼肌纤维化中的作用，更深入地探讨损伤骨骼肌纤维化的发生机制，为探讨新的治疗途径提供思路和理论依据。

骨骼肌急性钝挫伤后 TGFβ-Smad 信号通路被激活，通过活化 Smad2 和 Smad3（成为pSmad2、pSmad3）来激活该通路，随后pSmad2/3在Smad4的帮助下入核作为转录因子，共同调控下游基因的表达，引发损伤骨骼肌的纤维化。我们发现Smad4调控的基因有相当一部分为微小非编码RNA（miR），但这些miR的功能尚有待研究。.通过一系列实验，我们发现miR-146，miR-122，miR-24受TGF-β/Smad信号通路的调控，并且其受到Smad4的转录抑制作用。这提示这些miR可能参与了TGF-β/Smad4信号通路介导的骨骼肌钝挫伤后纤维化的发生发展。进一步，我们在体外及体内环境中分别通过mimics和agomir上调这些miRs的表达，随后发现这些miRs可显著抑制C2C12成肌细胞分泌胶原、分化为肌成纤维细胞，以及骨骼肌损伤后的胶原沉积。.miR发挥功能的机制是转录后调控，即通过抑制mRNA的翻译或介导其降解实现自身功能。我们通过生物信息学分析，以及一系列体内外实验发现，miR-146的靶基因正是其转录抑制因子Smad4，而miR-122的靶基因是TGF-β受体II（Tgfbr2），miR-24的靶基因是Smad2，也就是说Smad4下调的这些miR就是对TGF-β/Smad4信号通路发挥抑制作用的miR。由此，我们探明了TGF-β/Smad4信号通路得以在纤维化过程中不断增强的机制：即Smad4通过转录抑制作用解除了其所调控的miRs对自身TGF-β/Smad4信号通路的抑制作用。进一步，借助这些对骨骼肌纤维化的理解，我们也应用了植物提取物“柚皮素”治疗骨骼肌钝挫伤后的纤维化。柚皮素可特异性下调Smad3的表达，下调TGF-β/Smad信号通路的活性。.此外，在实践过程中，我们发现骨骼肌钝挫伤造模的重复性仍不尽如人意。为了使研究得以顺利开展，我们也申请了两项实用新型专利，以便于小动物骨骼肌钝挫伤造模。