NMDA受体NR2B亚型在成年神经发生中细胞特异性调控方式的研究

研究NMDA受体NR2B亚型在成年神经发生中的调控机制，对于细致了解成年神经发生中新生神经元选择性存活的复杂生理过程和未来研发神经保护的治疗策略，具有重要的意义。前期研究中我们发现，NR2B亚型在新生神经元的选择性存活、整合、突触功能的建立过程中起着至关重要的作用。基于NR2B的发育特点以及其与钙信号传导通路的密切关系，我们推断，NR2B在新生神经元的选择性生存以及整合，神经突触可塑性方面起着决策性的指导作用，发生在突触连接形成的关键时期，是通过信息依赖/细胞特异性的调节方式来实现的。CaMKII以及ERK1/2钙信号传导通路在调控中处于信息依赖的关键环节。本项目拟采用单细胞基因敲除，神经电生理，激光共聚焦显微镜，行为学检测等方法和技术，从新生神经元形态变化，神经元标志物，神经电生理特性，离子通道动力学以及行为学等入手，深入探讨NR2B在成年神经发生的新生神经元发育过程中的调控机制。

成年神经发生是哺乳动物中枢神经系统中一个非常奇特的现象：终身持续出现在某些特定的区域，新生神经元参与嗅球以及海马的某些特定功能，并且参与某些类型的学习以及记忆。鉴于脑损伤后锥体神经元的不可再生性，成年神经发生因其独特的特点，给脑损伤的神经修复、功能重建的研究带来了众多期望。NMDA受体NR2B亚型因具有独特的、胚胎期内高度广泛表达的发育特点备受关注。传统的全脑NR2B基因敲除方法使得动物在出生后即死亡，提示NR2B亚型在围胚胎期脑功能维持方面起着重要作用，最近的研究指出NR2B亚型在神经元突触可塑性的调节方面起着指导性的决策作用。因此，本课题通过逆转录病毒介导、条件性基因敲除的方法，特异性敲除成年神经发生中起源于侧脑室SVZ和海马齿状核颗粒下层的新生颗粒神经元中NR2B基因，观察NMDA受体NR2B亚型对新生神经元存活、形态发育、神经活性、功能性整合方面的影响。本项目研究发现，逆转录病毒Cre酶重组转化效率约为94%。在NR2Bfl/fl转基因小鼠中， Cre-loxp重组酶系统工作可以成功建立新生神经元NR2B基因敲除模型。在成年嗅球新生神经元中，NR2B基因敲除引起大量新生神经元死亡，该作用显著发生在神经元出生后2-4周——突触形成的高发时期，该选择性生存为NR2B特异性，不能被NR2A取代；进一步研究17dpi嗅球新生神经元发现，NR2B基因敲除对嗅球颗粒细胞的树突形态发生无显著影响，但显著减低神经活性。通过基因技术标记突触后致密物PSD-95和突触前synaptophysin蛋白，观察到谷氨酸能突触在NR2B基因敲除神经元中形成，超微水平电镜同时观察到类似现象，但电生理研究发现，NR2B基因敲除影响谷氨酸能突触功能成熟，从而影响嗅球兴奋性神经网络的构建。在海马成年新生神经元当中，NR2B基因对其生存、树突长度、谷氨酸突触形成无显著影响；与嗅球新生神经元类似的是：NR2B基因敲除显著减低神经元神经活性，谷氨酸突触功能受损。而NR2B基因所介导的生理过程，部分是通过调控活ERK途径实现的。综上所述，本研究的主要意义在于，首次系统地阐述了NMDA受体NR2B亚型对不同发生部位的成年新生神经元的选择性生存、形态学发育、神经活性、谷氨酸突触发生、功能成熟以及兴奋性神经网络的构建等过程的影响，有利于对成年神经发生过程进行有效调控，为神经恢复治疗提供广阔前景。