仿生颗粒单层膜调控人类多潜能干细胞的心肌分化与高通量药物筛查

Heart failure is one of the most common causes for people over 65 years of age. It is the top two of the leading cause of death worldwide. Due to a shortage of cardiac sources, heart tissue engineering is one potential approach to resolving heart failure. Mature cardiomyocytes play a decisive role in cardiac tissue engineering and in vitro disease models. However, the current cell culture techniques of stem cells are not effective in generation of adult-like mature cardiomyocytes, thus hindering the development of cardiac tissue engineering and drug screening. In this study, biomimetic microenvironments using colloidal self-assembly monolayers (CSAMs) composed of heterogeneous nanotopographies and chemistries will be fabricated and used to regulate the skeleton, signal transduction, and differentiation of stem cells. The advantage of this new substrate is that it can be developed into a high-throughput platform for rapid screening of cell-material interactions. Along with optogenetic control, the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) on CSAMs will be studied using gene and protein assays. Cardiac spheroids using mature hPSC-CMs will be generated on the CSAMs as a high throughput platform for disease modelling and drug screening. CSAMs, a next generation stem cell culture tools, have great potential in regenerative medicine to provide better cell sources for cardiac tissue engineering and heart failure patients more accurate prediction.

心力衰竭简称心衰，是65岁以上老人就诊的最常见原因之一，在世界各国的死亡原因中长期排名前三名。由于心脏来源的短缺导致换心手术困难，药物治疗与心脏组织工程是目前主要的解决手段。两种治疗方式皆需要有成熟的心肌细胞作为体外模型或动力来源，然而目前的体外2D干细胞扩增与分化技术尚未能有效的达到此目的。生物工程方法构建材料表面的微环境用于细胞培养是一种较为稳定且经济的方法。申报人近年开发了一种新型细胞培养基材称为颗粒自组装单层膜，其具有丰富的表面微结构与化学信号，可用来调控干细胞骨架、形态与分化效率。此新型基材的优势是可以发展成为高通量平台，针对细胞-材料相互作用进行快速筛选。本研究利用此平台对人类多潜能干细胞的扩增与心肌分化进行研究，旨在得到高品质干细胞与成熟的心肌细胞并用作体外筛药模型，提供心脏组织工程更优良的细胞来源与心衰病患更准确的投药预测。

人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)提供了细胞治疗、疾病建模和药物筛选等应用方面的重大进展。然而，一直以来hiPSC-CM的分化方案效率不高，也经常产生不成熟的hiPSC-CM。在本研究中，我们透过一种称为单层二元胶体晶体(Binary Colloidal Crystals, BCCs)来调控hiPSC的行为与分化，目标是提升分化效率与产生更成熟的hiPSC-CM。首先，我们采用不同尺寸和不同材料的颗粒作为材料，产生了四种BCCs，缩写为2PS, 5PS, 2PM和5PM。.BCCs具有复杂的表面微/纳米形貌和异质化学，对细胞黏附具有重要调节功能。结果表明，hiPSCs在PM表面形成更高的多能细胞标记物(Oct4, Nanog和Sox2)与球形形态。分化30 天后，PM表面的hiPSC-CMs明显改善肌原纤维的超微结构、钙信号和电生理特性，表明PM表面可产生更成熟的hiPSC-CMs。其中，在5PM产生的hiPSC-CMs在基因表达和蛋白质表达(ssTnI和cTnI)，都更类似于成人心脏组织。我们进一步证明了5PM表面促进了钙粘蛋白在心脏发育过程中的转换(从E-到N-)、成熟N-cadherin表达与心脏发生标志物(GATA4，MEF2c和NKX2.5)。该研究表明，特殊的表面纳米形貌在hiPSC培养和原位CM分化是有益的。这种简单的方法可以成为hiPSC-CM的下一代技术。.基于以上发现，我们确定了生物机械传导可促进hiPSC-CM分化，我们进一步探索5PM的生物学机制。我们针对细胞核、细胞骨架和表观遗传状态等进行分析，使用原子力显微镜、分子生物学分析以及转座酶可及染色质的测序(ATAC-seq)。结果显示，hiPSC在5PM上呈现球形，细胞核的硬度更高，染色质可进入性下降，其原因是组蛋白赖氨酸甲基转移酶SETDB1进入细胞核的增加和组蛋白H3K9me3修饰增加。使用ROCK抑制剂进行验证，降低细胞骨架张力后，减弱了SETDB1的核积聚，这表明该效应依赖于细胞骨架。此外，SETDB1的敲除反转了 5PM对hiPSC-CM分化的促进作用，表明5PM对hiPSC传递的生物机械传导信号转化为生物信号，因此增加了hiPSC-CM的分化。以上结果表明5PM表面的效应应该是普遍的。这个研究的发现将有助于利用材料刺激干细胞分化、材料生物学和干细胞生物工程。