植物乳杆菌代谢低聚果糖转录调控机制的研究

Although the selective stimulation of Fructooligosaccharides (FOS) to lactic acid bacteria in the gut has been proven both in vivo and in vitro, study on the pathways and regulatory mechanism for FOS metabolism is still in its infancy. In our previous study, a systems biology strategy was used to describe the metabolic pathways for FOS metabolism by Lactobacillus plantarum and the results showed that two clusters were involved in the metabolic process. To understand the regularity for FOS metabolism in L.plantarum, this study is focused on the regulation of gene transcription. First, transcription units and start sites of two clusters are analyzed respectively and the expression of the target genes is determined with different carbon sources. Then, the regulation relationships of the transcription factors towards target genes are studied by construction of gene knockout and revertant mutants. The identification of the specific binding between transcription factors and the corresponding sites in the promoter regions is finished by the strategy of affinity screening. On the basis of the study above, interactions between transcription factors, binding sites and RNA polymerases are analyzed and local transcriptional regulatory networks of FOS metabolism in L. plantarum are constructed to investigate the response of strains in response to changes of carbon source. This work will help clarify the transcriptional regulation for FOS metabolism in L. plantarum and lay the basis for further studying the mechanisms of FOS utilization for the strain in the gut.

低聚果糖（FOS）对肠道中乳酸菌的选择性增殖作用已被大量体内和体外研究证实，但是关于其代谢通路及调控机理的研究还处于起步阶段。前期研究中，申请人采用系统生物学策略研究并发现了两个基因簇参与到植物乳杆菌利用FOS的代谢过程。为了更深入了解植物乳杆菌代谢FOS的生理活动规律，本课题从基因转录调控的角度出发，首先分析两个基因簇各自的转录单元和转录起始位点，测定靶基因在不同碳源培养下的表达情况；通过构建基因敲除和回补突变株研究各调控因子对靶基因的调控关系，采用亲和力筛选策略鉴定转录因子与启动子区相应位点的特异性结合。在上述基础上，分析转录因子、结合位点与RNA聚合酶之间的相互作用，构建FOS代谢的局部转录调控网络，探讨植物乳杆菌应对碳源变化的响应机制。通过本课题的实施揭示植物乳杆菌利用FOS的转录调控机制，为进一步通过体内实验探索其在肠道内利用FOS的生理活动过程奠定基础。

本项目针对目前对于乳酸菌代谢低聚果糖调控机理不明确等问题，以转录因子CcpA、SacR1和SacR2为主要研究对象，分析并验证各调控因子对靶基因的调控关系。采用基于亲和力筛选的生物学策略建立转录因子与靶基因启动子区结合位点的相互作用；结合生物信息学和数学建模手段构建植物乳杆菌代谢FOS的全局调控网络，主要结论如下：（1）基因簇sacPTS1有两个操纵子转录单元组成，其中，操纵子sacK和pts1为一个操纵子单元，操纵子sacA、sacR和agl2为一个操纵子单元；基因簇sacPTS2是一个完整的操纵子；利用生物信息学软件在靶基因上发现了6个潜在的CcpA结合的cre位点，2个SacR1和1个SacR2潜在结合的位点。（2）构建了三个转录调控因子的异源表达载体。EMSA实验证实了CcpA转录因子与cre位点的特异性结合，ChIP-qPCR实验确定了CcpA对靶基因启动子区DNA具有很高的富集度；SacR1和SacR2转录因子与靶基因启动子区的特异性结合也通过EMSA实验进行了证实。（3）利用Cre-loxP敲除系统分别构建了三个转录因子的敲除突变株。ccpA基因的缺失，导致植物乳杆菌在混合碳源下二次生长现象的消失。RNA-seq实验表明7-15%的基因发生了差异化表达：参与碳水化合物代谢的基因主要发生了上调，而下调最为显著的是参与脂肪酸合成的基因；通过调控方式的分析，发现 CcpA可以通过直接、间接和直接-间接相结合三种方式对靶基因进行调控。在ccpA基因敲除的基础之上对sacR1和sacR2基因进行敲除，导致sacPTS1和sacPTS26基因簇上的基因完全去阻遏，所有受到抑制的基因得到释放。（4）利用ChIP-seq实验在植物乳杆菌中共捕获到507个不同富集倍数peaks，鉴定出5个motif，在植物乳杆菌基因组上共寻找到159个调控基因。结合RNA-seq数据，共发现39个基因受CcpA的直接调控。以CcpA为中心，包括局部调控因子SacR1和SacR2在内构建了全局调控网络模型，证明了植物乳杆菌代谢低聚果糖受到全局调控和局部调控的双重效应。综上所述，本项目利用系统生物学策略揭示植物乳杆菌利用FOS的转录调控机制，为进一步通过体内实验探索植物乳杆菌在肠道内利用FOS 的生理活动规律奠定基础。