酮基合酶MarO催化maremycin中哌嗪二酮的酰胺键形成和成环释放机制

Modular type I polyketide synthases (PKSs) are multifunctional enzymes that catalyze the production of polyketide natural products, many of which exhibit important biological activities, like erythromycin etc. β-keto synthase (KS) catalyzed the C-C bond formation during polyketide chain elongation indicated that KS plays an important role in polyketide assembly line. Maremycins are diketopiperazines alkaloid which have been isolated from the marine actinomycetes Streptomyces sp. B9173. We have previously cloned and sequenced the maremycin biosynthetic gene cluster. In vivo and in vitro characterizations of the maremycin biosynthetic machinery have suggested that MarO, the free standing type I ketosynthase, might catalyzed the amide bond formation and ring release during the diketopiperazine biosynthesis. Here we will confirm the function of MarO by in vivo experiment, characterize the ketosynthase MarO catalyze amide bond formation and elucidate the mechanism by in vitro work. This work will not only represent a new model for diketopiperazine formation and ring release, but also expand the enzymology of type I ketosynthase, and might be exploited to develop the genetic element for application in synthetic biology.

I型聚酮合酶是一类重要的次级代谢产物生物合成酶系，负责合成了大量具有重要生理活性的次级代谢物如红霉素等。其中酮基合酶催化碳-碳键的形成实现碳链的延伸，在聚酮化合物生物合成中极为重要。Maremycin是链霉菌Streptomyces sp. B9173产生的一系列具有哌嗪二酮母核结构的生物碱。前期克隆的maremycin生物合成基因簇结合一系列基因敲除实验暗示游离的I型酮基合酶MarO催化酰胺键的形成并完成哌嗪二酮成环释放。本项目拟通过 ①体内遗传学实验确定MarO参与哌嗪二酮环的生物合成，②体外酶学实验解析MarO催化酰胺键形成的功能，③阐明聚酮合酶MarO催化酰胺键形成的关键活性位点和酶学特性，④研究其中独特的成环释放机制。本研究将不仅提供一种新的哌嗪二酮成环释放模型，拓展酮基合酶催化功能的多样性，还可为MarO作为可操作元件实现在合成生物学中的应用提供理论依据。

Maremycins家族化合物是由链霉菌Streptomyces sp. B9173产生的一系列具有哌嗪二酮母核结构的生物碱。前期通过克隆产生菌中maremycins的生物合成基因簇，结合一系列基因敲除实验和对部分关键酶的生化验证，提出了初步的生物合成途径，并推测游离I型酮基合酶MarO催化酰胺键的形成并完成哌嗪二酮成环释放。.本项目研究过程中，首先对该生物合成途径进行深入的解析和验证：在变铅青链霉菌中构建异源表达体系，确定基因簇中17个基因即可负责maremycins家族化合物各组分的合成；基于生物信息学分析和体内实验确认NRPS相关基因MarM，MarQ，MarJ和酮基合酶MarA, MarB，MarC，MarD，MarL and MarO参与哌嗪二酮骨架合成；体外实验确认MarQ中的MT domain特异性催化半胱氨酸的S-甲基化，形成特殊的甲基半胱氨酸结构单元，与MarM加载甲基半胱氨酸缩合形成的二肽，作为哌嗪二酮骨架的前体；通过与同源蛋白进行比较，分析maremycins生物合成基因簇中酮基合酶MarO的保守结构域和关键氨基酸，确定I型酮基合酶的保守关键氨基酸也存在于MarO中；对MarO中的三个酮基合酶保守氨基酸进行定点突变和回补，构建不同的MarO突变株并进行发酵验证，结果显示突变株均不再产生maremycins。这一结果不仅证实MarO参与maremycins哌嗪二酮环的生物合成，且表明其中酮基合酶的关键氨基酸与maremycins产生相关；对maremycins生物合成途径的细致分析，结合基因敲除结果，提出该生物合成途径的前体分别是由非核糖体肽合成酶催化β-甲基色氨酸和丝氨酸或半胱氨酸形成PCP连接的线二肽MarM-MeTrp-MeCys，和聚酮合酶途径形成的MarL-2’-羧基-3’-羟基-环戊烷酮，随后MarO催化二者缩合，同时SnoL家族蛋白MarP控制途径分化，进而产生maremycins的不同组分。该研究对原先基于生物信息学分析和部分体内实验预测的maremycins生物合成途径进行了修正，提出了更为合理的生物合成模型，为研究该家族化合物的结构多样性和不同组分间的相互转化关系提供了重要的理论依据，也拓展了我们对哌嗪二酮类化合物生物合成机理的认知。