单分子酶促反应与分子构象动力学研究

建立蛋白质动力学特性与蛋白质结构和功能之间的关系一直是人们关注的重要研究课题，也是揭示生命体奥秘的必要基础。酶蛋白动力学过程涉及从皮秒尺度的局域振动到毫秒量级的构象变化，分子构象动力学在酶促反应过程中起着极为重要的作用。单分子技术为人们获得掩盖于酶促反应过程中包括分子构象变化中间态在内的深层次信息、理解其中重要的物理化学机制提供了重要手段。该项目以辣根过氧化物酶（HRP）作为模型研究分子体系，利用单分子多通道全内反射荧光显微镜(TIRFM)系统、单分子对荧光共振能量转移(spFRET)技术并结合时间相关光谱技术以及统计学分析，在单分子层次上实时、同步观测酶反应动力学过程，建立酶反应与分子构象变化等参量之间的直接关联，为深入理解和揭示酶促反应的动力学物理化学机制、实现单分子操纵和调控酶促反应提供重要的科学依据，并为单分子层次上实时研究分子动态学过程提供重要的技术和思路。

建立蛋白质动力学特性与蛋白质结构和功能之间的关系一直是人们关注的重要研究课题，也是揭示生命奥秘的必要基础。蛋白分子构象动力学在蛋白实现其生物功能过程中起着重要的作用，涉及蛋白与其底物之间的相互识别、相互作用以及产物释放和分离等过程。本项目首先自行设计和搭建了单分子多通道全内反射荧光显微镜(TIRFM)系统，为研究蛋白在实现功能过程中的分子构象动力学提供了重要条件。以拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶（GPX3）和硫氧还蛋白酶(TRX9)为模型研究分子体系，利用搭建的TIRFM系统、结合蛋白的定点突变和定点标记、单分子对荧光共振能量转移(spFRET)和统计学分析，在单分子层次上实时、同步观测了GPX3和TRX9相互作用的动力学过程。研究发现，拟南芥GPX3酶蛋白在实现去除ROS的过程中，除了以谷胱甘肽(GSH)为还原酶以外，还可以硫氧还蛋白作为电子供体完成其氧化还原态的调整与变化。GPX3和TRX9相互作用过程中存在相互识别、电子交换和分离三个主要动态过程。其中，识别的主要驱动力来自于长程静电相互作用；二硫键的形成具有两种不同的结合方式；在氧化态的GPX3和还原态的TRX9泊靠之后，到最终分离存在有三种不同类型的构象配置。从初态和终态的变化过程中，分别观察到了两种不同的构象中间态，对应着不同的FRET效率、空间距离以及停留时间，这两种构象中间态分别反映了GPX3中Cysteine 80与TRX9中的Cysteine 57和Cysteine 60两个位点进行电子交换和相应构象态演变形式。同时，还获得了氧化态TRX9蛋白构象变化调控其二聚化过程的动力学证据。所取得的研究结果不仅在动力学上揭示了GPX3和TRX9酶蛋白实现功能的物理化学机制，为深入理解GPX3和TRX9蛋白在信号传导中的作用提供了动力学依据，还为在单分子层次上实时研究大分子动态学过程及科学机制提供了重要的方法和途径。