棉铃虫精巢、表皮细胞系对AcMNPV不同应答反应的分子机制研究

杆状病毒感染宿主细胞后双方相互作用、相互调节，细胞或被感染、病毒扩增，或发生凋亡抵御病毒复制，以往研究多以杆状病毒为主,而从宿主细胞角度研究细胞的功能作用及机理的报道较少。我们建立了棉铃虫精巢、表皮细胞系，发现AcMNPV在精巢细胞中大量扩增,但在表皮细胞中扩增极少并引起凋亡，这种同一昆虫不同细胞系对相同病毒发生不同应答反应的报道前所未有,为研究宿主细胞抗感染和被感染的不同分子机制提供了很好的可比较的研究模型,通过形态学观察发现两种细胞模型有明显不同的结构变化,还检测到一些差异表达基因。本项目拟对两种细胞被病毒上调或下调的功能基因采用RNAi和过表达,结合RT-PCR、荧光定量PCR、MTT法及细胞结构染色法等研究该基因对其它基因的调控、对病毒扩增量或细胞凋亡率及细胞结构的影响等功能,旨在揭示棉铃虫宿主细胞被感染和抗感染的不同分子机制,为害虫生物控制新策略提供理论依据。

病毒感染细胞后双方的相互作用最终决定了细胞的存活及被感染状态。本研究利用杆状病毒AcMNPV感染棉铃虫表皮细胞系和精巢细胞系后表皮细胞大量凋亡、精巢细胞被感染的模型，从宿主角度探讨同种昆虫不同细胞系对病毒不同反应的机制。通过双向电泳、质谱分析、文献检索及转录组测序等方法获得了棉铃虫表皮、精巢细胞系被病毒感染前后的差异表达基因，我们选取了某些基因如adf，thymosin，PABPN1，p53，grim等进行基因克隆、抗体制备、表达模式分析、基因干扰或过表达及形态学观察、病毒测定等，对其在病毒感染的宿主细胞中的作用及机制进行了研究，已取得的结果：1、棉铃虫精巢细胞系被AcMNPV感染后不凋亡，但病毒复制量却不高，荧光化学显示细胞质中F-actin明显减少，进一步发现病毒感染细胞后基因adf 及thymosin表达显著上调，dsRNA干扰其表达均引起病毒增多，推测adf和thymosin参与调节微丝骨架的解聚或去装配而降低病毒复制；棉铃虫表皮细胞系被AcMNPV感染后其adf 和Thymosin表达没有显著变化，而α、β微管蛋白表达下调，表明AcMNPV感染表皮细胞中微管参与调控。2、AcMNPV感染棉铃虫表皮细胞系后宿主PABPN1表达上调，免疫荧光显示PABPN1主要定位于细胞核，病毒感染后24 h时自核移出到细胞质，过表达PABPN1后AcMNPV感染细胞12-48 h时病毒复制量由明显低于对照组快速增多至显著高于对照组，感染24-48h时过表达组病毒量的显著增多与PABPN1出核的时间相吻合，提示病毒可能操纵宿主的PABPN1使其出核，利于病毒扩增。3、克隆了棉铃虫p53基因，在表皮细胞系中过表达p53可促使某些细胞凋亡，表明该基因有促凋亡作用。然而干扰p53表达后并没有使AcMNPV感染的表皮细胞凋亡率减少，而病毒的滴度却降低了约7倍，过表达p53后感染AcMNPV，结果过表达组的细胞存活比非过表达组多，提示在病毒感染的棉铃虫表皮细胞中p53主要起修复作用，使细胞存活而利于病毒复制。4、AcMNPV感染表皮细胞后凋亡相关基因grim，foxO，PCD在3-12 h持续上调，随后下调，p53基因在12-48h表达最高，干扰grim，则p53下调foxO上调。