神经介素U调控猪免疫功能的分子机理研究

Neuromedin U(NMU) is neuropeptide separated from pig spinal cord and functions through its two receptors(NMUR1 and NMUR2). It has many biological functions, including smooth muscle contraction,regulation of food intake and energy homeostasis, gastrointestine function, blood pressure, stress, immune, nociception, reproduction and endocrine, etc. Systematic study of NMU in pig and regulation of NMU on immune function has not been found in the literature. On the basis of cloning of pig NMUR gene by us, the program will carry out the following researches with RT-PCR, immunohistochemistry, ELISA, western blot, cell culture: expression of NMU and its receptors in immune organs and immune cells; effect of NMU on macrophage, cell proliferation and secretion of cytokines of immune cells(macrophages, NK cells, dendrite cells, splenic lymphocytes), and on cell signal pathways and cell cycles in vitro; effect of NMU on cytokine levels in serum and secretion of cytokines in lymphatic organs after injection of NMU into lateral ventricle or vein; changes of NMU and its receptors after pig is affected by porcine pseudorabies virus. Through comprehensive analysis of the results from anatomy, physiology and pathology,in vivo and in vitro, this study will discover the target and molecular mechanisms of regulation of NMU on immune function, which will provide a new thought and new way for preventing and controling disease and developing new drugs.

神经介素U（NMU）是从猪脊髓分离的神经肽，通过其2种受体（NMUR1和NMUR2）起作用，具有刺激平滑肌收缩，调节摄食和能量平衡，影响胃肠功能、血压、应激、免疫、伤害性感觉、生殖内分泌等生物学功能。文献中未见对猪及免疫调节的系统研究。本项目拟采用RT-PCR、免疫组化、ELISA、western blot、细胞培养等方法，在本研究室克隆出猪NMU-R基因的基础上，研究猪NMU及其受体在免疫器官和免疫细胞的表达，NMU在体外对免疫细胞（肺泡巨噬细胞、NK细胞、树突细胞、脾淋巴细胞）吞噬功能、细胞增殖、细胞因子分泌的影响及其对细胞信号通路和细胞周期的影响，静脉或脑室注射NMU后对猪血清和免疫器官细胞因子分泌的影响，猪人工感染伪狂犬病时NMU及其受体的变化规律，通过对形态学、生理学、病理学、体外与体内研究结果的综合分析，揭示NMU调控猪免疫的作用靶点及分子机制，为疾病防控和新药开发提供新思路。

已有研究表明，NMU具有免疫调节的作用，但文献中未见对猪NMU及其免疫调节作用的系统研究。本项目克隆了猪NMU及其受体的CDs，比较了与其他动物的差异，发现猪NMU及其受体与其他哺乳动物有较高的同源性，猪NMU、NMUR1和NMUR2基因分别位于第8、15和16号染色体，猪NMU及其受体mRNA和蛋白在免疫器官表达分布。研究了NMU及其受体在猪免疫细胞（脾淋巴细胞、肺泡巨噬细胞、NK细胞和树突细胞）上的分布、NMU在体外对这些免疫细胞功能（细胞增殖和凋亡、巨噬细胞吞噬功能、NK细胞杀伤作用、细胞因子分泌）的影响及其可能的机制，结果发现，NMU和NMUR1在猪这些免疫细胞表达，NMU可刺激脾淋巴细胞的增殖，并对PHA/LPS刺激淋巴细胞增殖有协同作用，可影响脾淋巴细胞细胞因子的分泌和细胞周期。NMU可促进肺泡巨噬细胞的吞噬作用和影响细胞因子的分泌。NMU在体外可促进PBLs的活性，提高NK细胞对K562细胞的杀伤作用，影响NK细胞细胞因子的分泌，且影响NK细胞IFN-γ和IL-6的分泌通过PLC、PI3K和MEK信号通路（不通过JAK通路）。NMU在体外促进DC的增殖，抑制DC的凋亡，影响iDC的吞噬能力，介导DC活化T淋巴细胞的增殖，影响DC细胞因子的分泌，且促进IL-6和TNF-α分泌通过PLC、JAK、PI3K和MEK通路，但抑制IL-10分泌不通过MEK信号通路。给猪侧脑室注射NMU可影响血清细胞因子的水平及下丘脑、垂体和一些免疫器官NMUR和部分细胞因子的表达。给猪鼻腔接种人工感染PRV后，下丘脑、垂体和部分淋巴器官NMU及其受体的基因表达及血清细胞因子的水平发生一定的变化。本研究结果表明，NMU及其受体在猪免疫器官和免疫细胞表达分布，体内注射NMU可影响细胞因子的分泌，在体外NMU可影响免疫细胞的功能，并通过不同的信号通路影响细胞因子的分泌，人工感染病毒后下丘脑、垂体和免疫器官NMU及其受体、细胞因子的分泌发生一定的变化，以影响疾病的发生发展过程，从而参与对猪免疫的调控，进而揭示了NMU调控猪免疫的作用靶点及分子机制，为疾病防控和新药开发提供了新思路。