紫花苜蓿WRKY33转录因子调控抗逆性的分子机制

Alfalfa is the most important legume forage in the world, and the decline in production and quality caused by adverse environmental stress has severely constrained the development of the alfalfa industry. It is of great theoretical and practical significance to strengthen the mining of alfalfa stress-resistance gene resources and further analyze the molecular genetic mechanism of stress resistance, for guide the genetic breeding and production. The WRKY gene is a type of transcription factor widely found in plants and regulates various biotic and abiotic resistances of plants. In this project, based on the Alfalfa MsWRKY33 transcription factor gene which was screened out in the previous NSFC project, we propose a multidisciplinary study, including functional genomics, molecular genetics, bioinformatics, transcriptomics, molecular biology as well as the stress resistance evaluation analysis for following target：Investigate the expression pattern of MsWRKY33 gene, identify the stress-tolerance pathways involved in alfalfa; Screen and verify downstream genes regulated by MsWRKY33, and construct a gene network of stress-resistance regulated by MsWRKY33 in alfalfa, so as to decipher the genetic mechanism of multiple-stress tolerance of alfalfa. The proposed project will advance our understanding in genetic mechanism of stress-resistance in alfalfa. The data to be generated in this project will contribute to theoretical basis associated with stress tolerance breeding in alfalfa. Moreover, the outcomes of this project will provide practicable gene and germplasm resources for alfalfa breeding.

紫花苜蓿是全世界最重要的豆科牧草，逆境造成的减产严重制约着紫花苜蓿产业的发展。加强紫花苜蓿抗逆基因的挖掘，深入解析抗逆分子机理，对于指导遗传育种和生产实际具有十分重要的理论和实践意义。WRKY是植物中广泛存在的一类转录因子，调控植物多种生物和非生物抗性。本项目以上一个青年基金筛选的紫花苜蓿WRKY33转录因子基因为研究对象，通过功能基因组学、分子遗传学、生物信息学、转录组学等学科，利用ChIP-seq、RNA-seq、转基因等手段重点研究：分析MsWRKY33基因的表达模式，明确其在紫花苜蓿中参与的抗逆途径；筛选并验证MsWRKY33调控的下游基因，构建其调控紫花苜蓿抗逆性的基因网络，揭示该基因抗逆性调控的分子机制。项目的完成将在理论上建立MsWRKY33转录因子调控紫花苜蓿多重抗性的分子模型，推动苜蓿抗逆的基础理论研究，在实践上为紫花苜蓿抗逆育种提供可用的基因和种质材料，为生产服务。

紫花苜蓿是全世界最重要的豆科牧草，然而逆境造成的减产严重制约着紫花苜蓿产业的发展。加强紫花苜蓿抗逆基因的挖掘，深入解析抗逆分子机理，对于指导遗传育种和生产实际具有十分重要的理论和实践意义。WRKY是植物中广泛存在的一类转录因子，参与植物的抗病反应，还影响抗衰老以及多种生长发育过程，近年来的多项研究表明，WRKY转录因子在植物的非生物抗性中也发挥非常重要的作用。.本项目以紫花苜蓿“中苜1号”为研究对象，通过生物信息学、分子遗传学、转录组学、分子生物学等学科，利用RNA-seq、转基因、Y2H、BiFC等手段重点研究：利用生物信息学手段完成了紫花苜蓿基因组中WRKY基因家族的鉴定，分析了该基因家族的结构及系统分类；利用qRT-PCR和转基因结合GUS组织化学染色研究了紫花苜蓿 MsWRKY33 基因的时空表达模式以及不同外源处理情况下的表达丰度变化，明确了MsWRKY33 参与的逆境响应；通过遗传转化和生理表型分析，明确了MsWRKY33对PstDC3000引起的细菌性叶斑病抗性具有正向调控作用；通过遗传转化、耐盐性评价，明确了MsWRKY33的耐盐生物学功能，进而利用Y2H和RNA-seq技术筛选到了MsWRKY33的互作蛋白MsCaMBP25和下游转录调控基因MsERF5，并利用Y2H和BiFC技术验证了MsWRKY33和MsCaMBP25的互作，利用Y1H和荧光素酶互补（LUC）技术验证了MsWRKY33对MsERF5的转录调控。.通过项目的实施，我们证明了MsWRKY33参与多种逆境响应，并最终解析了该基因调控紫花苜蓿耐盐性的分子机制：MsWRKY33通过两种途径正向调节紫花苜蓿的耐盐性。盐胁迫激活MsWRKY33的表达，MsWRKY33的快速积累使得MsWRKY33蛋白与MsCaMBP25功能片段相互作用，可能阻断细胞中的Ca2+信号转导。另一方面，MsWRKY33高表达促使MsWRKY33直接结合MsERF5启动子上进一步激活MsERF5 基因的表达，从而上调下游ROS清除基因，导致紫花苜蓿的高耐盐性。.项目的完成在理论上建立了MsWRKY33转录因子调控紫花苜蓿多重抗性的分子模型，拓展了饲草WRKY转录因子家族基因的内容，推动苜蓿抗逆基础理论研究发展，在实践上为紫花苜蓿抗逆育种提供可用的基因和种质材料，为产业服务。