新型环形病毒HGyV/AGV2分子流行及其致病性

Chicken anemia virus (CAV) was the earliest identified member and the only known representative isolate in the gyrovirus genus. Since 2011, CAV associated novel gyrovirus sequences HGyV/AGV2，GyV3，GyV4，GyV5 and GyV6 have been identified not only in chicken, but also in the skin swabs, blood and stool samples from human. These novel gyrovirus pose risk for public health. Can these novel viruses induce the same pathogenesis with CAV in chick? What about the molecular epidemiology of these novel viruses in the domestic flocks? Little is known about these questions. In this study, we plan to perform molecular epidemiology surveillance for HGyV/AGV2 in domestic flocks, construct the HGyV/AGV2 infectious clones to rescue viruses. And the pathogenesis of HGyV/AGV2 will be evaluated in vitro and in vivo. This project will not only clarify the molecular epidemiology and the pathogenesis of HGyV/AGV2, but also pave the way for further investigating and evaluating the risk of these novel gyrovirus to public health.

鸡传染性贫血病毒（CAV）是圆环病毒科环形病毒属中最早被鉴定，也是目前该属中唯一经细胞培养分离到的成员。自2011年，CAV相关的新型环形病毒序列HGyV/AGV2，GyV3，GyV4，GyV5以及GyV6，不仅在鸡体中被鉴定；而且在人的皮肤棉试、血液以及粪便样品中鉴定。提示，研究这些新型环形病毒具有潜在的公共卫生意义。那么，这些新型环形病毒是否与CAV一样，对雏鸡具有致病性？它们在国内鸡群的分子流行情况又是如何？这些问题均有待进一步阐明。本项目拟开展国内鸡群HGyV/AGV2的分子流行病学，构建HGyV/AGV2的传染性分子克隆，拯救出HGyV/AGV2病毒；在细胞与动物水平对HGyV/AGV2的致病性进行研究。本项目的开展，不仅对明确国内鸡群HGyV/AGV2的分子流行情况及其致病性具有重要的基础理论价值，而且对进一步研究其它新型环形病毒的公共卫生意义具有重要的指导意义。

为明确国内鸡群及人群中是否存在AGV2，首先建立了检测AGV2的PCR方法。以TA克隆阳性质粒为模版进行的灵敏度检测发现，该PCR扩增AGV2的灵敏度可达2.7个拷贝数。对4个不同的活禽市场共54份鸡群羽囊组织样品以及人的178份血样样品的检测发现12个AGV2阳性样品，其中10个来自活禽市场鸡群，另2个来自人血清样品。4个不同活禽市场鸡群AGV2的阳性率分别为25%, 12.5%, 15.8%以及20%；人血清样品AGV2的阳性率为1.1%。氨基酸序列分析发现，本研究检测到的12个AGV2序列间的同源性为98.3％-100％，而与NCBI数据库中已报道的AGV2序列的同源性在92.2％-99.1％。值得注意的是，这12个AGV2序列与NCBI中AGV2原型株Ave3以及国内人源株China的相应序列的同源性分别仅为92.2％-93％以及93%–93.9% ，而与检测于人及雪貂的CL33，G13和915F06007相应序列的同源性达99.1％。进化树进一步分析发现，国内检测到AGV2可以分为两个分支。另外，在一肿瘤发病鸡群的诊断与检测中发现，AGV2与CAV以及MDV存在共感染。为拯救AGV2病毒，从临床AGV2阳性样品中，通过PCR方法扩增出AGV2全基因组，分别构建了单拷贝和双拷贝AGV2全基因组传染性克隆。通过间接免疫荧光方法证明单拷贝AGV2全基因组成功表达AGV2衣壳蛋白VP2和VP3的基础上，利用MSB1和HD11细胞对单拷贝和双拷贝两种AGV2全基因组传染性克隆尝试了病毒拯救。为开展AGV2血清学检测，本项目利用构建的AGV2的VP1、VP2、VP3蛋白原核表达产物，并制备了抗AGV2 VP2以及VP3的小鼠多克隆抗体。另外，为探究AGV2的VP3蛋白中可能的潜在磷酸化位点对AGV3 VP3凋亡功能影响，在预测AGV2 VP3蛋白中4个潜在磷酸化位点的基础上，进行了真核表达载体的构建，并评价了这4个潜在磷酸化位点对AGV2 VP3凋亡功能的影响。发现单个磷酸化位点不影响AGV2 VP3蛋白的定位及其凋亡功能。这些研究成果与发现不仅为进一步开展AGV2流行病学调查、探究AGV2相关疾病、而且为揭示AGV2关键蛋白VP1、VP2、VP3功能提供了材料，打下了基础。