干细胞微环境对小鼠卵母细胞发育的调控及其诱发孤雌激活的机制研究

提高体外成熟（IVM）卵母细胞质量，有效激活体细胞核移植（SCNT）卵母细胞，在辅助生殖、动物克隆或治疗性克隆领域具有重要意义。本课题组前期研究发现，骨髓间充质干细胞（MSC）条件培养液（CM）能够促进体外培养的小鼠卵母细胞/卵泡成熟，提高胚胎质量；并且能有效激活过暴露于CM的MII卵母细胞，具体机制尚未阐明。本研究拟采用卵泡膜干细胞（TSC）作为对照，进一步探讨干细胞微环境对卵母细胞发育、孤雌活化的调控作用，及其对SCNT卵母细胞的激活效率，并分析获得的胚胎干细胞（ESC）全能性；通过高分辨2-D电泳和图像分析寻找两种干细胞CM中蛋白斑点差异，蛋白质质谱技术鉴定，设计干预实验分析效应因子，从而探讨作用机制，旨在完善卵母细胞体外培养体系，寻求SCNT卵母细胞有效激活方法，拓宽ESC获取途径。

提高体外成熟（in vitro maturation, IVM）卵母细胞质量，有效激活体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）卵母细胞，在辅助生殖、动物克隆或治疗性克隆领域具有重要意义。本课题组前期研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）条件培养液（conditioned medium, CM）能够促进体外培养的小鼠卵母细胞/卵泡成熟，提高胚胎质量；并且能有效激活过暴露于CM的MII卵母细胞，具体机制尚未阐明。本研究试图分析CM中的生物活性物质并阐明其作用机制。我们以卵泡膜干细胞（theca stem cells, TSC）作为参比细胞进行对比研究，结果显示TSC是定向干细胞，仅向卵泡膜细胞分化，而MSC则为多能干细胞。来自MSC和TSC的CM均可以促进GV期卵母细胞发育至MII期，且暴露CM 40min后诱发MII卵母细胞孤雌激活，但前者效率优于后者（P＜0.05）；囊胚形成率、ICM数量和ESC全能性两者无显著差异（P＞0.05）。为了进一步明确两种来源CM中生物活性因子差异及功能因子分析，我们通过2-D电泳和图像分析寻找两种CM中蛋白斑点差异，蛋白质质谱技术鉴定，设计干预实验分析效应因子。但是，2-D电泳结果显示存在高丰度蛋白干扰，通过分子筛滤过、切胶分析等手段仍无法有效去除干扰，shotgun质谱分析结果不满意。我们正在借助超滤、浓缩、层析等手段去除干扰蛋白。此外，我们通过磁珠分选、改进培养条件，分别从胎鼠和成年鼠卵巢组织内分离/原位标记，鉴定出生殖干细胞（Germline stem cells, GSC），解释了TSC培养过程中不断有卵母细胞排出是由于不合适的培养条件促进GSC分化，而非预存的卵母细胞，这与以往文献报道不一致。. 通过该课题的研究，我们发现了一种较为理想的IVM体系和卵母细胞激活方法，拓宽了获取无伦理争议ESC的途径。得益于该课题资助，我们课题小组共发表论文16篇，其中SCI论文3篇，单篇IF最高5.212；申请并获得授权的发明专利4项；参加国内学术会议3次，国外学术会议1次；培养硕士研究生7名，其中5人顺利毕业。