纳米自来水笔在诱导多能干细胞转染中的基础研究

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) has been proven to be promising in personalized drug toxicology testing, pharmaceutical screening, and disease diagnosis. However, the potential has far outpaced researcher's ability to efficiently generate and test iPSC-derived cells with the desired phenotypes. To address such shortcomings, the vision for the proposed project is to develop nano fountain probe (NFP) based nanomanipulating and nanotesting systems to realize molecular transportation and single cell transfection. Due to the advantages of precision positioning, high resolution deposition, and continuously delivery NFP is promising in improving the cell reprogramming rate. In this project, we propose to investigate three fundamental problems in NFP cell transfection: 1. Temperature, humidity, forces, and electrical field effects on increasing or decreasing the molecule transportation process; 2. The transportation and deposition mechanisms of the inducing factors within the microchannel, between the channel and the tip, and between the tip and the cell; 3. The transfection rate after the inducing factors are delivered into the cell.

转染过程复杂、细胞损害严重以及转染存活率低等问题已成为制约诱导性多能干细胞（iPSCs）技术走向应用的主要瓶颈，而纳米自来水笔（NFP）将蘸水笔纳米印刷术和微流控技术相结合，能够实现精确、微量和连续输送纳米粒子或生物分子，有望克服以上iPSCs中的瓶颈问题。本项目拟在自然基金项目（91123023）的基础上，发展一套基于NFP技术的纳米输送与操作新方法，实现分子传输与单细胞转染，并研究其在干细胞诱导中的基础问题：①温度、湿度、针尖载荷、电场强度与脉冲驻留时间等对介导过程的促进或抑制规律；②力-电耦合作用下诱导因子在微流道、微流道与针尖、针尖与细胞之间的传输与释放机理；③诱导因子导入后细胞的存活率与诱导成功率研究。本项目有望推动NFP技术在iPSCs中的应用，为发展更为可靠的单细胞转染技术提供有益的借鉴。

诱导多能干细胞（iPSCs）将基因片段等转染因子导入培养细胞，使其重编辑而得到类似胚胎干细胞，对再生医学、疾病模型建立和药物筛选等具有重要的应用价值。然而目前普遍采用的生物介导、化学介导和电场介导等技术通常存在细胞再编辑效率低、细胞存活率低和操作过程复杂等缺陷。本项目提出了一种利用纳米自来水笔（NFP）实现高效、高存活率细胞转染的方法，并研究了NFP在细胞转染中的基础问题，主要研究内容为（1）研究了针尖载荷、电场强度和脉冲驻留时间等因素对介导过程的促进和抑制规律；（2）研究了力-电耦合作用下诱导因子在微流道-针尖-细胞之间的传输与释放机理；（3）研究了提高转染因子导入后细胞的存活率与诱导成功率的方法。研究结果表明NFP针尖形貌对于穿透细胞膜以及提高转染效率具有重要影响，当针尖直径为20nm，驱动压力为0.6nN时，穿透率达到70%；外加驱动电压的临界电压为7.7V，当驱动电压的频率为200Hz，驻留时间为0.75s时可获得最佳的导入效率和最低的细胞死亡率；除此之外，导入效率还和分子浓度有关，降低分子浓度可提高导入效率，当分子浓度为0.01 ug/ul 时，导入效率可达95%以上。基于纳米自来水笔的细胞转染技术可实现精准的单细胞转染，通过调控针尖直径、介导电场的频率和电压以及控制合适的温湿度可大幅提高转染效率和细胞存活率，通过优化微流道和针尖形貌可实现转染因子的连续输送，该技术有望推动细胞转染技术的应用，为发展更为可靠的单细胞转染技术提供有益的借鉴。