4″-异戊酰螺旋霉素I生物合成调控系统及其基因工程改造的研究

必特霉素是由异源4"异戊酰基转移酶基因(ist)在螺旋霉素产生菌中表达的我国自主研发的基因工程药物，已完成三期临床，具有很好的疗效和安全性。其原始宿主菌-螺旋霉素产生菌初步鉴定是一个新种。但必特霉素为多组分抗生素，生产工艺和质控较复杂，通过基因阻断我们已获得只产生异戊酰螺旋霉素Ⅰ组分的菌种，而且实验证明在该菌株中引入正调控ist的acyB2基因，可使其产量及组分明显提高。本课题拟阐明AcyB2调控ist基因表达的靶点及其作用方式，确定螺旋霉素生物合成中的调控基因与ist和acyB2之间的相互关系，鉴定出影响ist和acyB2基因表达的未知调控基因，阐明宿主中对外源ist和acyB2基因表达的调控系统。比较在ist前引入强启动子和改造其调控基因的表达对异戊酰螺旋霉素Ⅰ组分和产量的影响，筛选出新的异戊酰螺旋霉素Ⅰ的基因工程高产菌株。

为了研究异戊酰螺旋霉素Ⅰ（异戊I）的生物合成调控系统，首先完成了异戊Ⅰ工程菌的全基因组测序，从序列中分析出螺旋霉素生物合成基因簇和外源的4"-异戊酰基转移酶基因(ist)的插入位置。通过全基因组检索并未发现生二素链霉菌中螺旋霉素生物合成的正调控基因saaR的同源基因，因此排除其参与异戊I的生物合成。在异戊I工程菌的螺旋霉素生物合成基因簇中存在4个可能的调控基因orf2、23、27和42，在螺旋霉素产生菌（S. spiramyceticus 1941）中分别对4个基因进行阻断和回复实验，证实orf23、27和42为螺旋霉素生物合成的正调控基因，其中orf27是首次证实为正调控基因。而阻断orf2却可以稍增加螺旋霉素的产量，说明其可能为负调控基因。通过生物信息学分析，bldD和lrp基因可能参与异戊Ⅰ的生物合成，检索全基因组序列获得二者的基因信息，通过凝胶阻滞实验证实Lrp可以与ist-acyB2、orf23和42的启动区特异性结合，而BldD只与ist-acyB2之间的启动区有结合活性。说明lrp和bldD基因很可能参与异戊I的生物合成调控，而对lrp基因的进一步改造将会提高异戊I的产量。从耐热链霉菌中首次克隆出acyB2的上一级调控基因cbmR，对acyB2和cbmR基因进行阻断和回复证实二者都是碳霉素生物合成的正调控基因，高表达acyB2可以提高碳霉素的产量，而cbmR高表达时却抑制碳霉素的产生。利用麦迪霉素生物合成基因簇中的双调控基因orf28-orf27与ist基因一起在变铅青链霉菌TK24共表达，可以将螺旋霉素高效转化为异戊酰螺旋霉素。而转化子TK24 [cbmR-acyB2-ist]和TK24 [srmR-srm40-ist]的转化效率要低于TK24 [acyB2-ist]和TK24 [srm40-ist]，其中TK24[acyB2-ist]的转化效率最高。在发酵培养基中加入4mM L-Leu可明显提高各转化子的异戊酰螺旋霉素的产量。利用CRISPR/Cas9系统，将orf4基因替换为强启动子ermE*p相连的ist基因，从而获得新的异戊I基因工程菌株。