玉米Ⅰ型细胞凋亡蛋白在 Rp1-D21 介导的超敏防卫反应中的功能研究

Exploring new plant disease resistance genes and investigating the mechanism of disease resistance is very important for crop genetic improvement. Metacaspase (MC) play important roles in regulating the hypersensitive response (HR) in plant. My preliminary results showed that 4 maize genes belonging to type Ⅰ MC suppressed Rp1-D21-mediated HR in Nicotiana.benthamiana, but the mechanism of how MC regulating HR is unclear. In this work, we will investigate the suppression role of type Ⅰ MC in Rp1-D21-mediated HR in N.benthamiana using Agrobacterium-mediated transient expression analysis. Then, the Uniform MC mutants from maize will be hybridized to Rp1-D21 mutant, to study the function of MC in regulating Rp1-D21-mediated HR in maize. The MC mutants will be inoculated with pathogens which can cause sever loss to maize, and to investigate the function of MC in maize disease resistance. Using MC proteins as baits to screen their interactors by yeast two-hybrid system (Y2H), combining the Y2H screening results with our previous data from genome-wide association study and RNA-seq, to identify genes involved in regulating Rp1-D21-mediated HR. We will further investigate the interaction between Rp1-D21, MC and their interactors by Co-IP, BiFC, etc. This work will provide evidence for the molecular mechanism of MC in regulating of R protein Rp1-mediated defense response. Novel gene identified in maize disease resistance will be benefit to the agricultural production.

挖掘植物抗病基因并揭示抗病机理，对作物遗传改良具有重要意义。植物细胞凋亡蛋白Metacaspase(MC)在超敏防卫反应(HR)中发挥重要功能。申请人初步研究表明，玉米中4个Ⅰ型MC抑制Rp1-D21在烟草中自发诱导的HR，然而其作用机理尚不清楚。本研究将通过农杆菌介导的瞬时表达，在烟草中研究Ⅰ型MC对Rp1-D21介导HR的抑制作用，进而通过MC突变体与Rp1-D21突变体杂交，在玉米中研究MC对Rp1-D21介导的HR的调控及其在抗病中的功能。通过酵母双杂交技术，结合已有的全基因组关联分析和全基因组表达谱结果，筛选参与调控Rp1-D21介导HR的MC的候选互作蛋白，并在烟草中研究候选互作蛋白的调控功能。通过蛋白互作研究技术确定MC与Rp1-D21和候选互作蛋白之间的相互作用。本研究将初步阐明MC在抗病蛋白Rp1介导的防卫反应中的功能和蛋白调控网络，并挖掘新的抗病基因以服务农业生产。

玉米作为粮食、饲料和工业原料兼用型作物，在粮食安全中占据重要地位。但由于病虫害日趋严重，再加上抗病品种相对缺乏，导致玉米产量和品质严重下滑。因此，挖掘抗病相关基因并揭示其分子机理，对作物遗传改良具有重要意义。利用NLR类蛋白调控免疫反应是植物应对病原菌侵染的重要防御系统，NLR类蛋白可与植物细胞中多种蛋白相互作用，形成植物免疫反应调控网络。半胱氨酸蛋白酶 (Metacaspases, MCs) 是一类参与调控细胞周期、生物个体衰老以及生物与非生物胁迫下诱导细胞凋亡的一类重要蛋白酶，且在植物免疫防御反应中发挥重要作用。然而，MCs调控植物免疫的作用机理及其与NLR类蛋白之间的关系尚不清楚。. 本研究以玉米中一个自发诱导超敏防卫反应（HR）的NLR类蛋白，Rp1-D21为研究工具，对玉米两个I型MC蛋白（ZmMC1和ZmMC2）参与调控HR的功能以及可能的作用机理进行了探究，获得主要研究结果有：1）通过烟草瞬时表达系统，证明ZmMC1和ZmMC2可以特异地抑制Rp1-D21全长或其信号域CCD21介导的HR表型。2）ZmMC1抑制HR的功能与P20和P10两个结构域的完整性有关，但与蛋白酶活性可能无关。3）ZmMC1和ZmMC2可与CCD21直接互作，并改变其原有的核质定位而定位于点状聚集体中；点状聚集体定位与自噬途径相关蛋白AtATG8a存在共定位，表明ZmMC1和ZmMC2对Rp1-D21介导HR的调控可能与细胞自噬途径相关。4）通过酵母双杂交实验，获得了ZmMC1在玉米中的3个候选互作蛋白。5）获得了ZmMC1的纯合突变体玉米株系和ZmMC1过表达的T1代玉米株系。. 本研究初步阐明了玉米中两个I型MC蛋白在抗病蛋白Rp1-D21介导HR中的调控功能和作用机理，获得的抗病相关基因可为玉米抗病遗传改良提供候选基因资源，获得的玉米遗传材料为后续开展玉米抗病鉴定和抗病调控机理研究提供了材料。