猪矮小性状相关miR-200s基因簇功能及表观遗传调控研究

我国小型猪具有体型小、遗传稳定等特点，已作为理想的实验动物模型和生物医学材料应用于多个领域，但其矮小性状的调控机制仍不清楚。果蝇的microRNA-8基因是调控果蝇体型大小的重要因子，能够与胰岛素信号通路上关键因子互作影响果蝇体型大小。但关于该基因在哺乳动物体型大小调控中的研究迄今国内外尚无报道。本课题组首次发现该基因在猪中存在同源类似物（microRNA-200基因簇），而且证实其序列、结构和表达特征与果蝇miR-8极为相似。据此我们提出假说：猪miR-200s基因簇通过靶标基因与胰岛素信号通路互作影响猪体型大小。为证实这一假说，本研究拟在已建立的五指山小型猪资源群体基础上，从分子、细胞、个体和群体四个层面对miR-200s基因簇分子特征、结构、功能和表达调控机制进行深入研究，明确miR-200s在猪矮小性状调控中的作用机理，提出猪矮小性状调控的新机制。

本项目项目组按照原定的研究计划，以小鼠和五指山猪为研究对象，通过分子生物学技术结合细胞学分析和模式动物研究，揭示了microRNA-200家族基因在动物脂肪沉积和体型控制方面的分子机理。研究主要获得以下结果：.（1)小鼠和猪microRNA-200家族基因（miR-200s）克隆和表达谱特征分析，发现了miR-200s在动物胚胎发育不同时期及不同组织中的表达模式，为研究该基因功能奠定了基础；(2)通过软件预测出miR-200s的靶标基因，验证了靶标与microRNA的互作；对靶标基因进行功能分类，选择与胰岛素信号通路相关的靶标基因进行功能验证，找到miR-200s发挥作用的重要信号通路；（3）制备了脂肪组织特异性敲除miR-200b/a/429基因簇的突变小鼠，并对小鼠表型进行分析，发现miR-200a/200b/429基因簇剔除不会致胚胎期死亡，敲除鼠表现出葡萄糖耐受性强于对照鼠，但出现了胰岛素抵抗症状；组织形态学观察结果显示：敲除鼠肌肉和脂肪组织切片无明显异常，但肝脏出现了明显的变性坏死；（4）高脂饲料饲喂15周后，突变小鼠较表现出明显的肥胖症状，经组织形态学分析证实这种肥胖是由于白色脂肪中脂肪细胞变大导致的；此外，小鼠还表现出明显的糖代谢紊乱和胰岛素抵抗特征。为了进一步分析胰岛素敏感性受损的特定部位，我们分别检测了胰岛素的主要靶器官：脂肪、肝脏和肌肉胰岛素刺激的Akt磷酸化变化，发现敲除小鼠脂肪和肝脏Akt磷酸化水平明显低于对照组，说明胰岛素信号敏感性明显低于对照组。（5）为探究miR-200a/200b/429基因簇敲除导致小鼠出现脂肪沉积异常的分子机制，我们检测了脂肪生成、分解和炎症反应相关的关键基因的表达情况。结果发现高脂饲料诱导后敲除小鼠敲除小鼠脂肪合成能力与野生型鼠相似，而脂肪分解关键基因的表达明显低于对照组，说明高脂饲料诱导敲除小鼠体内脂肪分解能力出现异常。说明miR-200s基因能够通过调控脂肪分解相关靶标基因HSL等调控动物脂肪生成和分解过程，并最终影响动物体型大小。. 经过3年的研究，初步阐明了miR-200家族在动物脂肪沉积及动物体型大小控制方面的分子机理。项目组共发表研究论文3篇（其中SCI收录1篇），培养人才6人（其中博士研究2名，硕士研究生3名，青年学术带头人1名）。项目负责人在2014年晋升为副研究员。