miR-let-7a在小鼠精原细胞自噬性死亡中的作用研究

Programmed cell death mediated by autophagy is known as autophagic cell death (ACD), a process involved in the regulation of microRNA (miRNA). MiR-let-7a is an important member of the let-7 family, and participates in autophagy and ubiquitin-proteasome system. However, the regulatory mechanisms of let-7a in autophagy has not been elucidated. In this project, we would establish the overexpression model of let-7a in mouse spermatogonia in vitro and in vivo, and investigate the regulatory function of let-7a via the IGF1/PI3K/Akt/mTORC1 signaling pathway in autophagy of mouse spermatogonia. In addition, we would establish a co-regulatory network of let-7a with genes and proteins, to screen for potential targets involved in let-7a-mediated autophagy in spermatogonia. These findings could provide a theoretical basis for revealing livestock infertility caused by spermatogonia death and to promote the development of veterinary obstetrics.

由自噬介导的程序性细胞死亡，被称为自噬性细胞死亡（Autophagic cell death，ACD），这一过程与微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）的调控作用有关。miR-let-7a（let-7a）是let-7家族的重要成员，参与自噬和蛋白质泛素化降解途径。然而，let-7a调控自噬的作用机制至今尚未阐明。本项目以小鼠精原细胞为研究对象，拟建立let-7a在体外和体内的过表达模型，从let-7a介导的IGF1/PI3K/Akt/mTORC1信号通路出发，验证let-7a在小鼠精原细胞自噬中的调控作用。此外，建立let-7a与基因和蛋白质的共调控网络，筛选参与精原细胞自噬相关的潜在靶点，与IGF1/PI3K/Akt/mTORC1信号通路一起阐明let-7a调控精原细胞自噬的作用机制。研究旨在为揭示精原细胞死亡导致的家畜不育研究提供理论依据，促进兽医产科学的发展。

精子发生依赖于生精细胞的增殖、分化和死亡之间的平衡。过度凋亡或自噬性死亡导致的精原细胞死亡会引起公畜不育，阐明精原细胞死亡的内在机制对揭示公畜不育的致病机理具有实际参考价值。本项目通过明确精原细胞凋亡和自噬的新机制，为阐明miR-let-7a调控IGF1/PI3K/Akt/mTOR信号通路在精原细胞自噬性死亡中的作用奠定基础。项目利用X射线照射小鼠和GC-1细胞，诱导精原细胞凋亡，明确p53激活与精原细胞凋亡的关系；利用siRNA技术敲低小鼠精原细胞p53表达，明确p53对精原细胞凋亡的影响；利用siRNA技术敲低小鼠精原细胞RPL23a表达，明确了RPL23a与p53激活的关系；验证p53介导的RPL23a-RPL11-MDM2信号通路在精原细胞凋亡中的作用，为阐明IGF/Akt/mTOR信号通路的作用机制奠定实验基础。结果发现，X射线诱导精原细胞凋亡、降低RPL23a的表达量与RPL11-MDM2-p53信号通路有一定关联；X射线诱导精原细胞凋亡具有时间和剂量依赖性，与p53的增加成正比，与RPL23a表达量呈负相关；敲低RPL23a会增加MDM2、p53、RPL11和p21的表达量，使GC-1细胞发生G1期阻滞和凋亡。敲低RPL23a减弱了RPL11与RPL23a的结合能力，促进了RPL23a与MDM2的相互作用，激活p53；与对照细胞相比，过表达RPL23a联合X射线照射对GC-1细胞凋亡和周期比例无显著影响；与对照细胞相比，敲低RPL23a能够增强X射线诱导的GC-1细胞周期阻滞和凋亡，激活线粒体凋亡途径，说明敲低RPL23a能够增加GC-1细胞的辐射敏感性。本研究从RPL23a与p53的关系出发，验证了p53介导的RPL23a-RPL11-MDM2信号通路在精原细胞凋亡中的作用，为阐明IGF/Akt/mTOR信号通路的作用机制奠定了实验基础，为公畜不育的致病机理研究提供了参考，为揭示精原细胞凋亡的分子机制提供了理论依据。