转录因子基因PtrICE1调控柑橘冷响应基因表达的分子机理研究

Periodic freezing injury occurred frequently in the world, which leading to gigantic economic losses. Introduced cold tolerance genes into citrus by transgenic technique can shorten the breeding cycle, and obtain the cold tolerant citrus cultivars quickly. ICE1 is the key transcription factor gene regulating the expression of plant cold responsive genes. We previously cloned PtrICE1 and its promoter from trifoliate orange (Poncirus trifoliata (L.) Raf.), which is the most cold hardy variety in citrus, and proved that PtrICE1 could improve the cold-resistance of plant using transgenetic technology. This project will deep study the PtrICE1 transcription factor activities including transactivation activity and DNA binding trait. The up and downstream regulated genes of PtrICE1 will be isolated using yeast one-hybrid and citrus gene chip analysis. Moreover, the temporal and spatial expression patterns of these genes will be studied using real-time PCR. The results of this project will help us to construct the theoretic model of PtrICE1 regulating the expression of citrus cold responsive genes, and find out more cold resistance genes that can be used in citrus cold resistance genetic engineering.

柑橘周期性冻害在世界范围内经常发生，造成了巨大的经济损失。采用转基因技术将抗寒基因导入柑橘中表达是缩短育种周期，快速获得柑橘抗寒品种的有效途径之一。ICE1是调控植物冷响应基因表达的关键转录因子基因。在前期研究中，我们已从柑橘类植物中最抗寒的枳（Poncirus trifoliata (L.) Raf.）中克隆出了PtrICE1基因及其启动子序列，并通过转基因技术证明该基因具有提高植物抗寒性的功能。本项目拟深入研究PtrICE1的转录激活和DNA结合特性等转录因子相关活性，并通过酵母单杂交、柑橘基因芯片表达谱分析等技术分离PtrICE1的上下游调控基因。然后通过实时定量PCR分析这些基因冷处理后的时空表达特性，从而建立起PtrICE1调控柑橘冷响应基因表达分子机理的理论模型，并顺着PtrICE1调控的上下游基因，找到更多的抗寒基因，为柑橘抗寒基因工程提供新的基因资源和理论基础。

柑橘是世界主栽果树之一，具有重要的经济价值。低温是影响柑橘产量和品质，限制柑橘地理分布的主要环境因子。ICE1 是调控植物冷响应基因表达，提高植物抗寒性的关键转录因子基因。我们的前期研究已经证明枳PtrICE1基因具有显著提高植物抗寒性的功能。本项目进一步研究了PtrICE1基因提高柑橘抗寒性的分子机理。首先，我们利用凝胶电泳迁移试验（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）和染色体免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）技术分别从体外和体内证明了PtrICE1蛋白能 与PtCBF和PtCBF1启动子上的MYC 元件结合。同时，通过酵母单杂交和瞬时共转化技术证明了PtrICE1蛋白在体外和体内均具有转录激活活性。然后，对5个PtrICE1启动子元件缺失片段进行分析，结果表明，5个启动子缺失片段均具有冷诱导活性，其中PtrICE1-Pro-1片段（含871 bp启动子序列）冷诱导活性最强，PtrICE1-Pro-5片段（含237 bp启动子序列）冷诱导活性最弱。另外，通过酵母单杂交筛选出了13个PtrICE1上游调控基因。转基因试验表明，在柠檬中超量表达PtrICE1可以提高转基因柠檬的抗寒性。转录组测序分析表明，与野生型柠檬比较，冷处理前和冷处理不同时间后，在超量表达PtrICE1的转基因柠檬中大量冷响应相关基因表达发生了显著的变化，这可能是导致转基因柠檬抗寒性增强的主要原因。荧光实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）结果表明，PtrICE1调控的冷响应基因在枳的不同器官中均具有冷诱导活性。综上所述，本项目揭示了PtrICE1转录因子的转录激活及DNA结合特性，找出了PtrICE1的上下游调控基因，从而阐明了PtrICE1调控冷响应基因表达，提高柑橘抗寒性的分子机制。