低温保存人类卵子和胚胎新技术的开发及应用研究

Cryopreservation of oocytes and embryos is one of the most key technologies in human assisted reproduction. However, both programmable freezing and vitrification have some disadvantages on survival. Recently, we first reported a novel laser-induced ultra-rapid cryopreservation method of mouse oocytes and embryos. The new cryopreservation metod has several advantages form both slow frrezing and vitrification. We developed a new “non-permeating solution” for cryopreservation of mouse oocytes and embryos. It is most important factor of the new method. Survivals of mouse oocytes and embryos approach 100%, and the rates of in vitro fertilization and in vitro development were both very high. Our findings conflict with current orthodox views: in order to undergo and survive. cells must be suspended in and permeated by solutes in the protective solutions. The aim of this study is by examining the cryobiological properties of human oocytes and embryos to successfully develop a new solution for cryopreservation based on mouse model. The designed “CryoJig” to manipulate the sample and trigger the laser. And we try to establish thermal energy absorption and heat transfer model of medium and samples in laser warming system. Finally, we will examine the ability of in vitro and in vivo development of oocytes and embryos after warming by laser pulse to develop a new method for cryopreservation of human oocytes and embryos.

低温保存卵子和胚胎是人类辅助生殖技术中最关键的技术之一。但是，目前广泛采用的程序化和玻璃化保存方法，均存在成活率逐渐降低等不足。最近，我们在世界上首次成功开发了“激光低温保存卵子和胚胎”的新技术。这项技术不但兼具程序化和玻璃化保存技术的优点还能克服二者自身的不足，其核心是使用“不含低温保护剂的保存液”。我们前期将该技术应用于小鼠模型的研究中，获得了接近100%的成活率、受精率和体外发育能力。这一结果，颠覆了“胚胎保存液必须含有渗透性保护剂”的经典低温生物学理论。本项目拟在前期建立的激光低温保存动物卵子和胚胎模型的基础上，进一步系统研究人卵子和胚胎的低温生物学特性，并设计新的低温保存液。同时设计新的样品控制和激光激发系统，建立激光能量吸收和热量传递的理论模型。通过评测激光解冻后卵子和胚胎的体内与体外发育能力，最终开发保存人类卵子和胚胎的新技术方案。

细胞冻结死亡的主要原因是细胞内冰的形成。在慢速冷冻中，通过充分而且缓慢地降温细胞来避免细胞内冰晶的形成，从而使渗透脱水导致其水与外界溶液和冰保持接近化学势平衡。冷却速度越快，细胞内的水偏离平衡的程度越高，偏离平衡的程度越高，细胞内的水就越过冷。过冷的细胞最终会在细胞内以低于零度的冰成核温度冻结。这些过程可以用四个耦合方程来定量描述。在这项研究中，主要是借助于小鼠模型，ICR品系的成熟雌性小鼠被诱导超排卵，交配，并收集合子期或桑椹胚期的胚胎作为研究对象。胚胎在1M的乙二醇PBS溶液中悬置15分钟后，移到样品架Linkam冷冻显微镜中，冷却至-7℃并植冰，然后观察和拍照，同时以0.5-20℃/min的速度冷却至-70℃。细胞内冰晶的形成显示为突然的“闪烁”，在本研究中观察到两种类型的细胞内冰晶形成方式。细胞外冰晶的平均温度为-7.7℃。在桑葚胚中，大约25%在胞外冰晶形成±1℃内变暗。这些我们称为“高温”冰晶。但是合子没有高温冰晶现象，所有合子都在远低于细胞外冰晶温度的下发生。推测高温冰晶是细胞外冰晶温度前细胞膜损伤或细胞膜被冰晶损伤的结果，我们将不再讨论它们。在大多数情况下，细胞内冰晶发生在-7.7℃以下，我们称之为“低温”冰晶。在合子和桑葚胚中，均未出现冷却速率为0.5°C/min的闪烁。几乎所有的样品都在4℃/min或更高的冷冻速率条件下闪过，但桑葚胚的温度分布要比合子宽得多。此外，桑葚胚 (-20.9℃) 比合子(-40.3℃) 的平均闪烁温度要高得多。我们基于水透过系数以及需要的能量计算水的动力学损失对冷冻速率和温度在小鼠受精卵和桑椹胚的影响。理论计算的概率与观测值吻合非常好，这证明了我们的理论模型是正确的。