TGF-β1/Klf4-miRNA-26a反馈环路调控肝癌侵袭和转移的机制研究

Nuclear transcription factor Klf4 is a growth suppressor gene in hepatocellular carcinoma(HCC). In the process of invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma, Klf4 how to regulate the upstream and downstream genes is unclear. In our previous study, transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) was cell dependent regulation of Klf4. We found that Klf4 negatively regulated TGF-β1 gene in HCC. Bioinformatics software predicted miRNA-26a regulated the expression of Klf4. Using miRNA microarray, we identified that Klf4 upregulated miRNA-26a expression in hepatocellular carcinoma. We suggest that there exists TGF-β1/Klf4-miRNA-26a feedback circuit in HCC. Using Real-time PCR, we detect the expression of miRNA-26a in HCC patients with primary tumor, metastasis, tumor adjacent tissues and hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potentials. From three aspects of cell, tissue samples, experimental animal model, this study will reveal the regulatory relationship between TGF-β1 and the transcription factor Klf4, and will clarify the molecular mechanism of TGF-β1/Klf4 feedback loop regulates the expression of miRNA-26a and in inhibiting invasion and metastasis of HCC. This study provides a theoretical basis for liver cancer new drug target selection, which has potential value in clinical application.

核转录因子Klf4是肝细胞癌（HCC）生长抑制基因，在HCC侵袭和转移过程中，Klf4对上游及下游基因的具体调控机制不清楚。前期研究发现，TGF-β1对Klf4调节是细胞依赖性的：在HCC中，Klf4可负调控TGF-β1基因。生物信息学软件预测miRNA-26a可调控Klf4表达；利用miRNA表达谱芯片，初步判断Klf4亦可反馈上调miRNA-26a表达。本研究设想，在HCC中存在TGF-β1/Klf4-miRNA-26a反馈调控环路，利用Real-time PCR技术检测HCC患者原发灶、转移灶、癌旁组织及不同转移潜能肝癌细胞中miRNA-26a表达，采用基因转染等技术，从细胞实验、组织标本、动物模型三个层面揭示肝癌中TGF-β1与Klf4之间的转录调控关系，阐明TGF-β1/Klf4反馈环路调控miRNA-26a表达抑制HCC侵袭和转移的分子机制，为肝癌药物新靶点选择提供理论依据。

核转录因子Klf4是肝细胞癌（HCC）生长抑制基因，在HCC侵袭和转移过程中，Klf4对上游及下游基因的具体调控机制不清楚，其中Klf4-miRNA反馈调控环路起重要作用。本项目研究内容包括：1. 利用miRNA芯片和数据库筛选Klf4调控的miRNA；2. 研究肝癌组织中Klf4与miR-31、miR-9-5p调控作用；3. 研究Klf4调控miR-31、miR-9-5p基因表达对肝癌细胞生物学行为的影响。4. 研究TGF-β1通过miRNA-135a-5p下调靶基因Klf4表达的机制；5. miRNA-135a-5p和Klf4对肝癌细胞生物学特性的影响；6. TGF-β1、miRNA-135a-5p和Klf4在人肝癌组织中的表达及临床意义。.研究发现：1.筛选Klf4调控的miRNA：通过miRNA芯片获得18个表达差异明显的miRNAs，包括8个上调miRNA，其中包括miR-31等。2. Klf4基因表达与肝癌分期、分级和HBV感染呈负相关，而miR-31的mRNA表达水平与分期呈负相关，过表达Klf4质粒的肝癌细胞中miR-31基因高表达，与miRNA芯片结果一致。3. microRNA数据库筛选Klf4调控的miR-9-5p：在数据库Targetscan、miRnada和miRNA Map中检索Klf4上游的miRNA，综合得分情况及文献报道，选定候选基因miR-9-5p。研究发现，miR-9-5p直接结合Klf4 3’-UTR区，并抑制其表达。肝癌细胞中miR-9-5p表达升高，Klf4表达降低；miR-9-5p下调Klf4的表达促进肝癌细胞增殖，抑制肝癌细胞凋亡；miR-9-5p下调Klf4的表达激活AKT信号通路相关蛋白；AKT抑制剂逆转miR-9-5p抑制肝癌细胞凋亡并促进细胞增殖。4. TGF-β1/miR-135a-5p/Klf4信号通路可以促进肝癌细胞的增殖和转移：在肝癌组织中，miR-135a-5p高表达，与Klf4表达呈负相关。TGF-β1在蛋白水平和mRNA水平均可下调Klf4的表达；TGF-β1可上调miR-135a-5p表达，miR-135a-5p直接作用于Klf4 3’-UTR；TGF-β1、Klf4和miR-135a-5p三者具有协同效应；miR-135a-5p通过下调Klf4的表达而促进肝癌细胞的增殖和转移。