纤维小体自组装用于酿酒酵母纤维素乙醇高效转化的研究

酿酒酵母异源组装纤维小体能具备纤维素降解能力，且酶效比游离纤维素酶高。目前，此类研究尚存在以下问题：（1）纤维素酶选择不合理；（2）胞内组装影响纤维小体跨膜展示；（3）单支架展示方式限制纤维小体产量及游离纤维小体形成；（4）对酶-底物-细胞复合协同效应缺乏深入了解。这不仅影响了纤维素乙醇的产量和转化率，而且导致细胞无法直接利用结晶型纤维素。本申请针对上述问题，拟通过基因重组手段，以嗜温性细菌的纤维素酶为催化元件，研究酿酒酵母中微型纤维小体的双支架（展示型）和单支架（游离型）胞外自组装，分析两种自组装方式引起的相互作用、结构变化与细胞的纤维素糖化和乙醇发酵能力之间的关系，探讨纤维小体引起的酶-酶、酶-底物-细胞协同效应以及展示型和游离型混菌发酵可能存在的细胞-细胞协同效应，并且阐明各协同效应的作用规律和内在机理。本研究成果有助于促进酿酒酵母作为CBP微生物在纤维素乙醇生物转化过程中的应用。

本课题通过在酿酒酵母细胞表面组装双支架微型纤维小体，成功使重组酿酒酵母获得直接降解纤维素，特别是结晶纤维素的能力，从而可以被用于纤维素乙醇的发酵。微型纤维小体的构建及其在细胞表面的吸附是由两个独立的微型支架分别完成的，这种特殊的组成方式可以尽可能地提高纤维小体的细胞表面展示量。三个纤维素酶，即celCCA (内切葡聚糖酶), celCCE (外切葡聚糖酶), Ccel_2454 (β-葡萄糖苷酶)，均克隆自嗜温性梭菌Clostridium cellulolyticum, 从而确保纤维素降解过程和酵母乙醇发酵过程的温度兼容性。在完全自主装模式(in vivo method)下，纤维素酶和微型支架I通过α-factor信号肽分泌到酵母胞外，所以纤维小体的组装和细胞表面锚定完全是在胞外由单个宿主自动完成的。在非完全自主装模式(in vitro method)下，展示有双支架的酿酒酵母被表达有纤维素酶的大肠杆菌细胞破碎液处理，或者与其它三种分泌表达纤维素酶的酿酒酵母混合，从而使微型纤维小体在胞外完成非完全自组装。免疫荧光显微镜，流式细胞仪(FACS), 以及纤维素乙醇发酵实验证实了双支架微型纤维小体在酿酒酵母表面的成功展示。 本课题分析了酶-酶协同效应，酶的邻近协同效应以及酶-底物-细胞协同效应，优化了锚定支架（微型支架II）的长度。重组酿酒酵母被用于羧甲基纤维素(CMC), 磷酸膨胀纤维素(PASC)和结晶纤维素(Avicel)的发酵实验。数据表明：该重组酵母对结晶纤维素的降解能力最强，纤维素乙醇的产量达1412 mg/L。本课题同样证实了表面展示的微型纤维小体在热稳定性和蛋白酶稳定性方面都优于游离型微型纤维小体。实验结果说明：通过在酿酒酵母细胞表面人为地构建纤维小体，可以实现酿酒酵母纤维素乙醇的直接发酵工艺。