FecB突变影响绵羊格拉夫卵泡氧化应激代谢的分子机制研究

By means of increasing the number of Graafian follicles, the FecB mutation made the ovulation rate and litter size improving in sheep. Previous studies have found that the level of oxidative stress in Graafian follicle fluid was significantly higher in FecB-carriers than non-carriers. However, the significance and mechanism of this physiological phenomenon are not clear. Grouping was performed according to the FecB genotype, then the samples in vivo such as peripheral venous blood, Graafian follicular fluid and cumulus-oocyte complexes (CoCs) from oestrus sheep were extracted to analyze the differences in level of oxidative stress. CoCs were cultured in vitro according to the FecB genotype as well, then oxidative stress, apoptosis and proliferation of cumulus granulosa cell, expression of related genes and proteins were evaluated. Based on the previous data of metabolomics and single-cell transcriptomics for ovine Graafian follicles, we combine with the results of this study, a signal pathway which mediating FecB mutation affecting the oxidative stress metabolism in ovine Graafian follicles will be constructed. Using ovarian frozen sections and cumulus granule cell culture systems, the biological functions of key genes will be verified. These results will reveal the molecular mechanism of FecB mutation affecting the oxidative stress in ovine Graafian follicles, and offer a theoretical basis for constructing the efficient breeding system in sheep by the introgression of FecB mutation.

FecB基因突变通过增加绵羊格拉夫卵泡数，从而提高其排卵数和产羔数。前期研究发现，携带FecB突变的高繁殖力绵羊，其格拉夫卵泡液的氧化应激水平极显著高于野生型个体，而这一生理现象的意义和机理并不明晰。本项目依据FecB基因型进行分组，抽取发情绵羊的外周静脉血、格拉夫卵泡液及卵丘-卵母细胞复合体（CoCs），分析体内样品的氧化应激水平差异。再依据FecB基因型分组体外培养CoCs，评估其氧化应激水平、卵丘颗粒细胞凋亡、增殖和相关基因及蛋白的表达调控。以前期绵羊卵巢格拉夫卵泡的代谢组学及单细胞转录组学数据为基础，结合本研究的试验结果，构建介导FecB突变影响绵羊格拉夫卵泡氧化应激代谢的信号调控通路。利用卵巢冰冻切片和卵丘颗粒细胞传代培养体系验证关键基因的生物学功能。本项目预期阐明FecB突变影响绵羊格拉夫卵泡氧化应激的分子机制，为进一步利用FecB基因构建肉羊高效繁育体系提供理论依据。

卵巢排卵是一个复杂的耗能过程，能引起格拉夫卵泡内的氧化应激代谢变化。FecB基因突变后可能改变了卵泡内的氧化应激状态，进而影响卵丘-卵母细胞复合体（CoCs）的发育命运，从而可能影响绵羊的排卵数和产羔数。本研究通过同期发情-超数排卵预处理三种FecB基因型试验母羊，以研究FecB突变对绵羊发情表型及血清激素和氧化应激指标的影响，并通过10×Genomics单细胞RNA-seq测序等技术构建FecB突变影响格拉夫卵泡氧化应激差异的信号调控通路，并对相关通路关键基因的表达调控进行验证。主要结果如下：.不论超排处理与否，携带FecB突变的绵羊个体，均表现出比FecB野生型组更高的卵泡形成个数。预示着FecB基因突变介导了其卵巢对外源超排激素的应答反应的差异。超排处理的BB型组外周血清FSH浓度显著高于其他各组；与此同时，同期非超排处理的BB型试验羊外周血清SOD浓度显著低于++型组，而血清MDA浓度显著高于++组；代表着该基因型绵羊可能承受着较高的氧化应激水平。.单细胞测序结果显示卵丘细胞的表达模式在FecB携带者和野生型个体之间是不同的；在卵丘颗粒细胞重要分支节点上包括FecB（BMPR1B）在内的BMP/SMAD信号通路及繁殖激素应答相关通路基因的表达情况，对于卵丘颗粒细胞的分化命运起到了重要作用；WW_VS_BB和WW_VS_WB差异表达基因均主要富集于代谢通路、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢和TCA循环等信号通路。通过添加NAC培养绵羊卵巢颗粒细胞，可有效促进颗粒细胞前期的增殖与细胞活体，对培养体系中的活性氧具有一定的清除作用。.撤栓后45-48h后的大部分格拉夫卵泡卵母细胞处于GVBD和MⅠ期，携带FecB基因（BB和+B）的卵丘细胞中SMAD基因RNA的荧光信号明显高于++型。说明作为FecB的下游信号基因SMAD4的表达量，在FecB突变后可能因为某种原因表达量上调了，从而一定程度上可能强化了BMP信号通路。免疫荧光结果显示BB型卵丘-卵母细胞复合体接受FSH的信号弱于++型，而接受LHCGR的信号则高于++型；意味着该时期的BB型卵丘-卵母细胞复合体率先从依赖于FSH激素信号转为依赖于LH激素信号。