无脊椎动物色氨酸羟化酶（TPH）基因分化的基础研究

脊椎动物体内三个芳香氨基酸羟化酶是单胺类神经递质合成链上的关键酶。然而，有关无脊椎动物体内单胺类递质的合成机制，特别是专一的色氨酸羟化酶（TPH）是否存在、存在的方式、作用机理及其基因独立分化的节点等科学问题尚不清楚，或不十分清楚。本项目研究将采用树脂石蜡切片技术和免疫组化、原位杂交及mRNA BLAST分析等技术，对处于不同进化地位的蚕蛾、蜚蠊（昆虫）、螯虾（甲壳）、沙蚕（环节）和水螅（腔肠）等代表动物体内的TPH及其mRNA进行系统地研究和分析，拟阐明各实验模型动物神经和外周是否存在两个独立的酶（TPHn和TPHu），追溯其基因独立的进化节点；明确动物界最原始的两胚层动物（水螅）体内是否也分化出独立的TPH。项目的完成可回答上述重要的科学问题，同时可为TPH、5-HT生理功能的研究奠定基础，也可为其它功能基因的研究提供新的参考思路。本研究目标的实现将改变以往对TPH进化路线的认识。

我们在前一基金项目（30470546）的续研和本项目立项研究中，采用自主创新的制片技术和免疫细胞化学方法，实现了模型动物脑内功能细胞胞内5-HT/TPHn共标，现已证明：1.昆虫脑内普遍存在神经性色氨酸羟化酶（TPHn，成果4-5）；2.实验证据证明鳌虾脑内也存在特异性TPHn（图7），这些神经功能细胞原位展现的可视证据，足以证明低等节肢动物体内存在TPHn；3.研究发现沙蚕中枢神经系统存在特异TPHn（图8，成果3，附件15），并初步对其TPHn cDNA全基因序列进行了扩增实验，目前正在进行5’RACE重复实验，以进一步优化实验条件，5‘测序待进行；4.实验结果证明，水螅外胚层及其基部神经网也存在明显的TPH阳性信号（图9），已定位少数5-HT/TPH共标细胞。可初步证明：在动物系统进化中，tph基因很可能在腔肠动物就已经从pah（苯丙氨酸羟化酶PAH）基因拷贝，独立行使其功能，有关芳香氨基酸羟化酶家族三个基因（pah，th和tph）进化的问题可初步辨析；5.建立了昆虫脑内功能细胞靶物质共定位技术方法和胞内相关信息物质（产物/限速酶或编码基因）可互为佐证的科学理念（成果1和2，附件1-18），在果蝇、蚂蚁和蟋蟀脑内首次发现5-HT神经激素能细胞群（AMP和ALCa）和5-HT神经调质能神经元（图1-2, 4-6），相关研究内容已发表（成果4）或正在修稿（二审）发表中；6.对果蝇脑内多巴胺（DA)及其合成限速酶酪氨酸羟化酶（TH）进行了初步研究，我们的实验结果已初步说明，国际相关研究很可能在研究理念、实验方法和科学结论上存在一些误区。几乎所有关于果蝇DA能系统的定位研究均以TH标记为依据，至今未见直接以DA为靶标定位果蝇脑内DA能系统的文章发表。我们认为，同属单胺类的DA与5-HT不同，在脊椎动物中，DA并不是酪氨酸代谢链的终产物，它除作为重要的神经递质发挥生理效应外，还是其他儿茶酚胺（肾上腺素和去甲肾上腺素）生物合成的前体物质。有研究表明，TH（DA）神经元还可能与章鱼胺（OA）的合成有关。综上，目前已有的研究还不能排除某些TH阳性细胞很可能具有其它递质功能，而非DA能细胞。因此，至少要实现DA和TH胞内共标（互为佐证），才能科学定位昆虫脑内DA能系统，相关综述正在准备投稿中。