锦鲤皮肤色素细胞分化和形成相关microRNA筛选和功能研究

The skin color is one of the most important genetic traits in fish, which is governed by a series of genes and transcription factors. To date, many researches of fish skin color determination have been studied. However, the functions of miRNAs in chromatophores differentiation and formation in fish has not been completely reported. In the project, Koi carp( Cyprinus carpio Koi) is as research subject to construct miRNAs profilings during chromatophores differentiation and formation. Then, we obtain the differently expressed miRNAs and filtrate miRNAs which target genes play roles in chromatophores differentiation and formation. In order to explore the functions of miRNAs, we use real time PCR, dual luciferase expression vector, miRNAs over-expression plasmid and miRNAs antagomir methods to explore the effect of candidate miRNA in chromatophores differentiation and formation on cell and animal level. The objects of the study are to acquire a series of miRNAs and illuminate the roles of miRNAs in chromatophores differentiation and formation. The results of this project can extend our thought and provide theoretical basis on miRNAs regulation mechanism in fish skin color determination.

体色是鱼类的重要遗传性状之一，多种基因和转录因子参与其形成过程。目前，人们对鱼类体色形成开展了大量研究，但miRNAs与鱼类色素细胞分化和形成的关系，迄今国内外尚无报道。项目以锦鲤为研究对象，从色素细胞分化和形成阶段入手，构建鱼类色素细胞分化和形成阶段的miRNAs表达谱，获得表达差异miRNAs，筛选与色素分化和形成相关的miRNAs，通过QRT-PCR、双荧光报告载体、miRNA过表达载体和miRNA antagomir等技术，从细胞和动物水平探讨miRNAs在锦鲤色素细胞分化和形成中的功能。本研究将获得一系列可能在鱼类色素细胞分化和形成中发挥调控作用的miRNAs，建立miRNAs在鱼类体色形成过程中的调控作用模型，揭示miRNA对鱼类色素细胞分化和形成的调控作用，为鱼类体色调控机制研究提供一种新的研究思路和理论基础。

锦鲤体色多样，但体色性状极不稳定，具有观赏价值的锦鲤需要万中挑一。因锦鲤体色形成的分子机制尚未明确，探索miRNAs在锦鲤色素细胞分化和形成中的作用是对锦鲤体色形成调控机制的有益补充和完善，对锦鲤遗传品质改良和种质资源开发也具有重要的研究意义。在国家自然基金的资助下，本项目以锦鲤为研究对象，通过观察锦鲤体色发生的过程，确定了锦鲤色素细胞分化和形成的关键时期，并利用高通量测序技术筛选了与色素形成相关的mRNA和miRNAs，利用分子生物学方法从细胞和动物水平对miRNAs参与锦鲤体色形成的机制进行了深入研究，目前各项研究工作均按照合同书顺利完成，取得的重要研究进展有以下四个方面：（1）对锦鲤体色发生时期进行观察，确定了锦鲤体色形成的6个关键节点；（2）在锦鲤体色发生4个主要阶段的mRNAs和miRNAs表达谱中获得了59和103个与体色形成相关的基因和miRNAs；（3）从候选miRNAs中挑选了3个miRNAs进行靶基因验证，确定miR-430-3p和ccr-miR-7132-3p的靶基因为scarb1和tyrp1；（4）合成miR-430-3p agomir注射鱼体，确定miR-430-3p可靶向抑制scarb1转录，降低scarb1蛋白表达，影响类胡萝卜素和蝶呤通路相关基因的表达。综上所述，本项目证实了miRNAs参与锦鲤色素细胞的分化和形成，研究结果有助于锦鲤体色性状遗传基础的解析，也为锦鲤遗传品质改良提供一定的理论依据。