猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列Body TRS在转录调控中的功能研究

Body transcription-regulating sequences (TRSs) play a crucial regulatory role in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) discontinuous subgenomic transcription. Little is known for such regulatory elements controlling PRRSV replication because of the lack of operational characteristics. Previously, we rescued of a recombinant PRRSV expressing an enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter gene as a separate transcription unit and the recombinant PRRSV was phenotypically stable in vitro. This proposal is aimed to 1) determine the role of Body TRSs in regulation of gene expression, replication and subgenomic transcription by using the recombinant PRRSVs carrying different Body TRSs, 2) determine the gene-specific characteristics of Body TRSs with Leader TRS by using the recombinant PRRSVs carrying different core sequence and its flanking sequences of Body TRSs, 3) determine the gene- and position-specific characteristics of Body TRSs by using the recombinant PRRSVs expressing two structural genes. This project is expected to uncover functions of Body TRSs in regulation of virus gene expression, replication and subgenomic transcription, and provide useful data for understanding of the replication and transcription regulation mechanisms of PRRSV.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）转录调控序列Body TRS是PRRSV"非连续性转录"方式中发挥核心作用的调控元件，其缺乏操作性的特性使其功能鲜有报道。此前我们通过反向遗传操作平台证实，PRRSV Body TRS可使EGFP作为PRRSV额外亚基因组被转录，且拯救病毒遗传性稳定。本项目拟利用作为PRRSV额外亚基因组被转录的EGFP为模型，通过携带不同Body TRS的EGFP重组病毒确定不同Body TRS在启动基因复制和亚基因组转录中的分子差异；利用携带不同核心结合序列和侧翼序列组合的Body TRS重组病毒确定其与Leader TRS结合的基因特异性；进一步通过拯救双表达PRRSV结构蛋白的重组病毒确定不同Body TRS转录调控的基因特异性和位置特异性；阐明不同Body TRS在PRRSV复制和亚基因组转录中的功能，为进一步揭示PRRSV复制和转录调控机制奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）转录调控序列Body TRS是PRRSV“非连续性转录”方式中发挥核心作用的调控元件，其缺乏操作性的特性使其功能鲜有报道。本项目利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）反向遗传操作技术，分别构建完成了多个携带HP-PRRSV不同Body TRS和EGFP标签的HP-PRRSV全长cDNA克隆，并拯救获得了携带不同Body TRS的EGFP的多株重组病毒，重组病毒中引入的EGFP基因在连续传代10代过程中未发生缺失、突变等现象，具有较好的稳定遗传性，重组病毒与亲本毒的生长特性基本一致。通过对荧光强度、Western Blot和Northern Blot等检测显示HP-PRRSV不同Body TRS在基因复制和亚基因组转录方面存在明显的分子差异。通过将HP-PRRSV不同Body TRS核心结合序列及侧翼序列进行互相替换，证实了不同核心结合序列和侧翼序列组合的Body TRS重组病毒其与Leader TRS结合不具有基因特异性；通过拯救携带过表达GP5a或GP2b的重组PRRSV，确定了不同Body TRS转录调控不存在基因特异性和位置特异性。此外，我们利用可视化重组HP-PRRSV对病毒在Marc-145细胞中整个病毒感染周期内的实时动态进行了活细胞观察，确定了PRRSV的复制周期约为10小时；我们还利用可视化重组HP-PRRSV建立了抗PRRSV药物快速筛选平台，并利用可视化重组HP-PRRSV对传统的病毒中和试验进行优化；我们还拯救了表达猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）或猪白细胞介素-4(pIL-4)的重组PRRSV，并与亲本毒株进行了全面比较。这些研究成果阐明了不同Body TRS在PRRSV复制和亚基因组转录中的功能，为进一步揭示PRRSV复制和转录调控机制奠定基础。