缺氧性非酒精性脂肪肝发病机制的研究：HIF-2α和内质网应激

缺氧损伤可诱导肝脏脂类代谢紊乱，加剧非酒精性脂肪肝发病的发生、发展及恶化，但具体调控机制目前尚未明确。缺氧诱导因子(HIF-2α)和内质网应激反应(ERS)是缺氧损伤的主要细胞应答机制，均能不同程度调节脂类代谢相关基因的表达。我们的前期工作表明HIF-2α可能是激活ERS的独立因素，预测两者可能与缺氧性脂类代谢障碍密切相关。本课题拟利用RNAi技术构建HIF-2α基因沉默表达载体并转染HepG2细胞，联合使用特异性化合物抑制或激活ERS，观察脂类代谢关键调控基因SREBP、FAS等的表达以及胆固醇和甘油三酯水平变化，分析缺氧条件下HIF-2α及ERS对肝细胞脂类代谢途径的影响，明确HIF-2α通过促进游离脂肪酸储积介导ERS及脂类代谢障碍的调控机制，同时对缺氧性脂类代谢障碍中相关信号传导途径进行初步研究。本课题将有助于深入了解缺氧性非酒精性脂肪肝病发病机制，为其针对性治疗提供新的理论依据。

NAFLD(非酒精性脂肪肝病)是一类以脂类代谢紊乱引起肝实质细胞脂肪变性和脂肪储积为其主要特征的疾病，遗传、环境、代谢和药物等多种因素参与疾病的发生发展过程。由于肝脏对氧浓度梯度的高度敏感性，氧代谢信号途径在缺氧性肝脏疾病中发挥着重要作用。HIF-2(缺氧诱导因子-2)是一类异二聚体组成的氧依赖性转录因子，是机体适应缺氧微环境的关键调节因子。而内质网应激是自身内稳态调控的另一重要途径。本研究着重研究人肝癌HepG2细胞中HIF-2在缺氧诱导的脂类代谢紊乱中的作用和潜在调控机制，并确证其与内质网应激通路之间的相互关系。. 我们根据HIF-2α基因序列，构建了小干扰RNA(siRNA)和shRNA质粒，分别对细胞进行转染，并使用G418筛选出稳定转染细胞株。western blot方法检测表明，瞬时和稳定转染HIF-2α干扰RNA均能有效抑制HepG2细胞中HIF-2α基因的表达。尼罗红(Nile Red)、菲律宾( Filipin)荧光染色及脂质定量试剂盒检测结果表明，HIF-2α沉默表达后减轻了由缺氧引起的脂类和胆固醇蓄积程度。抑制HIF-2α表达可促进胆固醇外排(ABCA1高表达)并部分降低ADRP引起的脂质摄入，而与脂肪酸合成(SREBP1, FAS)和β氧化(CPT-1α，HADH酶活性)以及胆固醇代谢相关基因(SREBP-2, LDLR, CYP7A1, ABCG5/8)未显示明显关联性。. Western blot结果显示, 缺氧条件下LO2细胞内质网应激相关标志性蛋白表达均显著增高。转染特异性siRNA抑制HIF-2α表达后，内质网应激及其诱导的细胞凋亡相应降低。在HIF-2α沉默表达的HpeG2细胞内，加载棕榈酸能够逆转内质网应激抑制作用。实验结果提示了HIF-2α通过促进细胞内游离脂肪酸蓄积，调控缺氧诱导内质网应激的激活。关于内质网应激对缺氧脂类代谢的影响目前正在研究之中，我们获得的结果显示，内质网应激与缺氧应激均能引起脂质蓄积，但所诱导的代谢途径并不完全一致，表明应有除HIF-2α外其他的调控途径参与其中。. 综上， HIF-2α通过调节脂肪酸摄入和胆固醇的外排途径，作用于缺氧诱导的细胞脂类代谢紊乱，并能够通过脂肪酸蓄积调控内质网应激通路，提示着HIF-2α与脂类稳态密切相关。研究为脂类代谢紊乱引起的疾病治疗提供了新的靶点。