热胁迫诱导表达的OsDBB锌指蛋白调控水稻DGD和Hsfs转录表达的机制研究

It's important theoretical and practical significance to elucidate the regulatory molecular mechanisms involved in gene expression related to thermotolerance. In previous work, we found the transcriptional expression of several members of double B-box zinc finger protein subfamily were induced by heat stress in Arabidopsis and rice. Besides, AtBBX18, as a member of this subfamily, is a negative regulator of thermotolerance by regulated the transcriptional expression of digalactosyldiacylglycerol synthase 1 (DGD1), and heat shock factor HsfA2 in Arabidopsis. However, those heat stress induced OsDBBs are unknown determinants involved in heat stress responses in rice, and how OsDBB involve in thermotolerance molecular signalling is poorly understood. Therefore, this research intends to carry out the following research areas: (1) systematically analysis of the cellar and organic expression of heat stress-induced OsDBB in response to heat stress. (2) systematically study thermotolerance phenotypes of heat stress-induced OsDBB transgenic rice plants; (3) we attempt to clarify the molecular mechanism of OsDBB in the regulation of DGD and Hsfs expression in rice. Above experiments will have important scientific significance to deeply understand the molecular genetic mechanism in response to hight temperature in rice.

研究调控植物耐热相关基因转录表达的分子机制具有重大理论和实践意义。在前期工作中，在拟南芥和水稻中都证明了多个光信号元件双B-box（DBB）型锌指蛋白家族成员的表达受到热胁迫的诱导，并发现其中一个成员AtBBX18能降低拟南芥的耐热性，且能调控二乳糖甘油酯合成酶DGD1和热击转录因子HsfA2等耐热相关基因的转录表达。然而水稻中受热胁迫诱导表达的OsBBX在耐热信号途径中的生物学功能以及调控耐热相关基因转录表达的分子机理所知甚少，因此，拟开展以下几方面研究：1）系统研究OsDBB基因响应热胁迫的组织细胞表达特征；2）阐明热诱导表达的OsDBB蛋白调控水稻响应热胁迫的生物学功能；3）试图从分子水平上阐明热胁迫诱导表达的OsDBB调控DGD和Hsfs转录表达的分子机制，对探明水稻耐受高温胁迫的分子遗传机制具有重要的科学意义。

随着灾难性高温气候的频繁出现，广泛筛选耐热相关基因和深入了解植物的耐热信号传导网络对保证农作物的品质和产量具有重要的理论和实践意义。本研究以粳稻日本晴和籼稻9311水稻中锌指蛋白双B-box亚家族基因（BBX）和二半乳糖甘油酯合成酶家族基因（DGD）进行了序列比对、进化关系和响应热胁迫的生物芯片和基因表达分析，发现多个在粳稻日本晴和籼稻9311中存在序列差异，且表达受热胁迫调控的BBX和DGD基因。成功构建了BBX22和DGD1基因的RNAi转基因水稻株系，并开展了苗期和孕穗期的耐热表型分析、耐热相关的生理生化指标分析和热胁迫信号传导关键基因的表达分析。与野生型比较，发现BBX22、BBX24和DGD1的RNAi转基因水稻苗期耐热性减弱但孕穗期的耐热性无明显差异，BBX22参与了热胁迫调控的防御性酶酶活力改变，BBX22、BBX24和DGD1均参与了HSFA2a和多个HSP的转录表达。其次，开展了OsDGD1启动子的克隆和表达载体构建，并成功获得了OsDGD1启动子融合GUS报告基因的转基因水稻材料，系统分析了OsDGD1基因组织表达特征，并进一步确定其表达受到热诱导。为挖掘更多与水稻孕穗期耐热性相关调控元件，本研究开展了孕穗期耐热水稻品种N22和热敏水稻品种9311幼穗中响应热胁迫的小RNA测序分析，发现多个与孕穗期耐热性相关的miRNA及其靶基因，随后针对表达受热胁迫调控明显的OsmiRNA398，开展了其敲除突变体STTM398水稻苗期和孕穗期的耐热表型分析和热胁迫信号传导关键基因的表达分析。与野生型比较，发现STTM398在苗期和孕穗期的耐热性均明显减弱， HSF和多个HSP的转录表达受调控，且miRNA的靶基因铜/锌超氧化物酶和超氧化物酶伴侣的表达也受到热胁迫的诱导，并且在热胁迫初期收到miRNA398抑制明显。上述结果表明，本研究发现了多个参与调控水稻耐热性的基因，加深了对水稻响应热胁迫的信号调控网络的认识，对开展耐热水稻的分子育种有积极的促进作用。