低剂量重金属联合暴露的神经元树突棘异常及其LIMK1/SSH1分子调控机制

Multi-factor and multi-level experiments design and high-speed cell quantitative analysis, they make it possible to challenge facing the difficulties in studying that the heavy metals (Pb, Cd, As and Hg) of major public health concern listed by the WHO cause early health adverse effects in co-exposure. We have identified the interaction dose between heavy metals after we did nearly 500 hundreds of experiments by the L_49（7^4）、L_16（2^4）orthogonal design and U8（8^5） uniform design. It starts the studies on the joint toxicity of more than three kinds of heavy metals. In this project, we will grasp the common typical pathological features of neuropsychiatric disease “abnormal neuron dendritic spines” as breakthrough point, and for first time carry out the research around the scientific hypothesis of “Low level heavy metals co-exposure to cognitive impairment--abnormal neuron dendritic spines--regulation and control of dendritic spines dynamic change by LIMK1 / SSH1 modification of phosphorylated cofilin”. Applying Confocal Laser Scanning Microscope, Patch Clamp Amplifier System, Flow Cytometry, morphologic quantitative analysis, as well as cellular and molecular techniques of siRNA, and so on, we will try to elucidate and answer the key scientific problems put forward in this project from multiple levels, multi-azimuth and multi-dimensional. Our study will provide a scientific basis for further to their health risk assessment, to protect and improve public health, prevention and treatment of neuropsychiatric disease.

多因素多水平的实验设计方法和高速细胞定量分析技术，使我们探索“WHO列出引起重大公共卫生的4种重金属联合暴露致早期健康损害效应研究”成为可能。我们通过L_49（7^4）、L_16（2^4）正交设计及U8（8^5）均匀设计等，经过近5百次的实验研究，基本确定了具有实际意义的上述重金属联合作用剂量，奠定了3种以上重金属之间交互作用毒性研究的基础。借此，本项目拟抓住常见神经精神疾病共同典型病理特征“神经元树突棘异常”为切入点，围绕“低剂量重金属联合暴露认知障碍-神经元树突棘异常-LIMK1/SSH1磷酸化修饰Cofilin调控树突棘动态变化”科学假说首次开展研究。拟采用激光共聚焦、膜片钳、细胞定量分析以及siRNA等分子生物学和神经生物学技术，试图从多水平、多层面、多维度，研究回答本项目所提出的关键科学问题，为开展多种重金属污染的健康危险度评价，保护和促进人群健康、防治神经精神疾病提供科学依据。

低剂量重金属联合暴露的健康损害具有广泛性和隐匿性，是亟待解决的公共卫生危机。尽早谋划、及时开展低剂量环境重金属联合暴露所致早期健康损害效应及其相关机制研究，对于保护和促进人群健康、预防疾病具有十分重要的理论意义和现实意义。本项目围绕“低剂量重金属联合暴露认知障碍—神经元树突棘异常—LIMK1/SSH1磷酸化修饰Cofilin调控树突棘动态变化”的科学假说展开研究。首先，采用神经行为、学习记忆等测试和脑片钳技术，在动物和人群水平上，发现了机体神经发育过程中的空间感知觉对低剂量重金属联合暴露更为敏感，易受到影响；且发现铅镉汞单个重金属和两个重金属间未影响行为能力时，三个重金属联合暴露对足月新生儿神经行为能力影响存在交互作用。其次，采用Golgi-Cox染色、激光共聚焦、细胞定量分析等技术，阐述了低剂量重金属早期神经毒性效应的神经元树突棘病理基础，即低剂量重金属联合暴露改变了正常发育进程中树突棘动态变化规律，重金属暴露剂量-时间依赖性的树突棘减少，且断乳期减少最为明显。随后，采用免疫印迹、免疫荧光等技术，证实了神经元树突棘内调节骨架肌动蛋白动态化过程的关键因子Cofilin在低剂量重金属联合暴露的神经元树突棘异常中的分子作用。最后，采用siRNA、免疫印迹等技术，在细胞水平上，明确了低剂量重金属联合暴露分别通过对LIMK1活化和SSH1调控 Cofilin 磷酸化和去磷酸化，从而改变神经元树突棘动态变化，导致神经行为和认知障碍。同时，发现高表达pLIMK1可以调高SSH1的表达，干扰SSH1同样可以调低p-LIMK1的表达，且LIMK1和SSH1之间相互作用存在于低剂量重金属混合暴露损害F-actin/G-actin平衡中，在此调节过程中，LIMK1的调节贡献作用较SSH1更显著，低剂量重金属联合具有类似LIMK1有效抑制剂BMS-5的作用。本项目的研究成果促进了对低剂量重金属联合暴露早期健康危害及其有关机制的理解，为多种重金属污染的健康风险评估，保护和促进人群健康提供了重要科学依据，为重金属联合暴露神经损害的防治干预靶标提供了新线索。