玉米小RNA随机过量表达体系的建立和功能研究

Small RNAs play pivotal roles in plant development and responses to both biotic and abiotic tresses. Maize contains large amount of conserved and specific small RNA species, and exploring their biological functions are important for the understanding of maize development and the application of molecular breeding. Although it is possible to overexpress small RNAs with artificial microRNA or synthetic tasiRNA techniques, only one small RNA species could be studied by either approach, which largely restricts the functional study and breeding application of the huge quantity of small RNAs in maize. Here we propose a new genomics expression system utilizing plant tasiRNA backbone and biogenesis machinery, to convert all of the maize small RNAs into tasiRNAs and randomly overexpress them in vivo. Small RNA-seq, mRNA-seq and degradome-seq will be conducted on the interesting lines to identify the genomic locus, category and abundance as well as target mRNAs of these small RNAs; ribosome profiling will be performed to investigate the translational inhibition of these small RNAs on their target gene expression. This project will benefit the systematic understanding of the biological functions of small RNAs in maize and mechanisms underlying their regulation on maize development; the accomplishment of this project will also provide new ideas for molecular breeding of maize.

小RNA对植物生长发育及抵抗生物与非生物胁迫具有重要作用。玉米基因组中具有大量的小RNA，研究这些小RNA的生物学功能对了解玉米生长发育和分子育种至关重要。目前虽然可以通过人工微小RNA及合成tasiRNA技术对特定小RNA进行过量表达，但这些技术只能对单一小RNA分子进行遗传操作，这严重限制了对大量玉米内源小RNA的功能研究和应用。本项目将利用植物tasiRNA的骨架序列和生物合成机制，建立一种新的基因组学表达系统，将玉米体内各种不同小RNA转换为tasiRNA并随机过量表达；通过分析小RNA文库、mRNA文库以及降解组文库，对各种小RNA的属性、丰度和靶基因进行研究；建立核糖体保护序列文库来探索小RNA对靶基因的翻译抑制活性。本项目的开展将有助于进一步阐释玉米小RNA的功能及其对玉米生长发育的调控机制，并将分子育种提供新思路。

小RNA对玉米等农作物生长发育、产量和抗性等方面具有重要的调节作用，但是目前由于转基因难度较大，以及缺乏高效的研究手段，导致玉米小RNA功能研究严重滞后，并限制了在分子设计育种中的应用。本项目设计并建立了一种可以对玉米所有内源小RNA进行高通量生物学功能研究的功能基因组学技术体系，并初步鉴定出一些在玉米生长发育中发挥重要作用的小RNA分子。我们利用植物反式作用小RNA的骨架序列及其生物合成机制，用ccdB基因替代其中的成熟小RNA对应序列，并将玉米体内所有内源小RNA随机插入到上述载体，转换为反式作用小RNA进行随机过量表达。利用该系统在烟草瞬时表达系统中对GFP小RNA进行过量表达，可以成功产生高丰度的、长度为21nt、具有5’尿嘧啶的小RNA,并高效对GFP靶基因进行表达调控；我们分别以表皮毛发育基因TRY、叶绿素合成基因CH42以及开花基因FT作为报告基因，利用该系统在拟南芥稳定表达系统中成功产生了大量目标小RNA，并对各自的靶基因进行了显著的下调表达；转基因植株分别产生了表皮毛成簇、叶片黄花和开花延迟的发育表型；玉米原生质体瞬时转化试验表明，该系统在玉米体内可以产生预期长度和丰度的小RNA。另外我们建立了一套专门针对microRNA功能的随机过表达体系，制备了玉米microRNA结合蛋白AGO1的特异性抗体，利用免疫沉淀技术成功富集了玉米microRNA并进行了随机过表达。目前已经完成玉米不同组织部位和发育时期内源小RNA随机过表达文库的制备，全基因组测序表明文库具有较大的覆盖度和较小的偏好性。通过对转基因后代进行筛，我们已经得到300余个转化事件，并鉴定出31个影响玉米株高、性别决定和养分利用等功能的小RNA。该系统的创新型在于可以通过一次遗传转化过程同时对玉米体内的所有小RNA进行随机过表达，从而高效揭示这些小RNA的生物学功能，同时大大降低转基因成本和周期。该技术体系还可以应用到小麦、高粱、花卉等其他农作物中，特别是对于那些转化成本和难度较高的农作物，必将大大促进小RNA的功能研究将，为分子育种提供重要工具和新思路。