环孢素A对植入前鼠胚滋养细胞分化和侵袭能力的影响

胚胎种植率低下是IVF-ET不能获得临床妊娠的关键因素，提高种植对于改善IVF-ET的临床妊娠具有重要的意义。胚胎滋养层细胞的侵蚀能力是影响囊胚孵出及着床的关键因素。既往研究表明浓度环孢素A能够增强来自绒毛组织的滋养细胞增生与侵袭，但其对植入前胚胎滋养层细胞的作用不明确。我们提出"环孢素A能够促进胚胎滋养层细胞的分化和侵袭，提高胚胎植入能力"。为证实这一假说，本研究设计用含不同浓度环孢素A的培养液培养小鼠植入前胚胎，观察胚胎细胞增生、滋养细胞与内细胞团分化、囊胚形成、囊胚孵出和囊胚在纤粘蛋白处理后的培养皿中的粘附能力，并检测滋养细胞标记Cdx2与内细胞团细胞的标记Oct4、囊胚孵出关键因子ISP1、整合素αvβ3、囊胚基质金属蛋白酶9及连接素的转录和表达水平，阐明环孢素A对植入前胚胎滋养细胞的分化与功能的影响，为用人为方法调节植入前胚胎滋养细胞分化与功能、改善胚胎种植能力提供理论基础。

本课题在体外研究CsA调节着床前小鼠胚胎发育与分化、细胞增殖及凋亡、囊胚粘附与侵袭的分子机制。研究按两部分进行。.第一部分：环孢素A对孵出前胚胎细胞增殖、凋亡、分化和囊胚形成的调节作用。探讨CsA对小鼠囊胚形成、细胞凋亡、细胞增殖和分化的调节作用。用含浓度为0、0.1、1.0和10μM CsA的培养液将胚胎从2dpc培养到4-5dpc，采用荧光染色、免疫荧光、TUNEL技术观察胚胎细胞总数、细胞分化、凋亡和囊胚形成。依据结果我们得出以下结论：1．在0.1-10μM浓度下，CsA对小鼠5dpc以前的囊胚形成和凋亡没有显著性影响。2．在0.1-10μM浓度下CsA使囊胚细胞数量增加，上调滋养细胞数量，这种影响呈现明显的剂量依赖性；不影响cICM和cICM/TB。3． CsA在0.1和1.0 μM时，明显上调cICM Oct4 mRNA 的转录，对滋养细胞特异分子Cdx2的mRNA转录没有显著影响。.第二部分 环孢素A调节小鼠囊胚孵出和着床能力的分子机制。 探索CsA对小鼠胚胎孵出和着床能力的调节和机制。用含浓度为0、0.1、1.0和10μM CsA的培养液将胚胎从2dpc培养到6 dpc，观察囊胚的付出功能；用含浓度为0、0.1、1.0和10μM CsA的培养液将胚胎在laminin包被的培养皿从5dpc培养到7-8dpc，观察胚胎的孵出、粘附和侵袭能力。并采用qRT-PCR测定itgβ3和MMP-9 mRNA转录水平，并应用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜观察其蛋白表达，用于进一步判断胚胎功能。得出以下结论：1．CsA不影响胚胎的孵出及相关酶ISP1 mRNA的转录。2．胚胎孵出后，CsA在0.1和1.0μM浓度下明显促进囊胚对LN的粘附；1.0μM CsA明显促进胚胎在LN上的伸展，因此CsA可能增强胚胎着床能力。3．CsA促进胚胎着床的分子机制则是基于滋养细胞的整合素αvβ3和MMP-9表达上调。.最终的结论是： 1. 0.1-10μM浓度下CsA使4dpc囊胚的总细胞数、滋养细胞数量增加；不影响滋养细胞特异分子Cdx2的mRNA转录，上调cICM Oct4 mRNA 的转录。2． CsA明显提高囊胚的粘附和伸展能力， CsA通过升调节小鼠胚胎整合素αβ3和MMP-9的表达，促进小鼠胚胎粘附与侵袭。提示CsA有利于孵出胚胎着床。