基于PMA核酸染料筛选土壤活性微生物的方法评价及其应用

Soil microbial total DNA mainly originate from extracellular DNA, viable and nonviable microorganisms. Therefore, the total DNA-derived signals often lead to overestimate the viable microbial population and diversity. However, the accurate and feasible method to selectively screen viable microorganisms from complex soil matrices has not been found. Use of PMA as intercalating dyes to covalently cross-link extracellular DNA or DNA from dead cells with compromised membrane integrity, this project aims to establish standard experimental procedures for screening viable cells from complex soil matrices. PMA concentration, incubation time and exposure time will be optimized, together with transcriptomics and stable isotope probing technique applied to evaluate the feasibility and accuracy of PMA method. Further, viable microbial communities will be separated from fresh soil, freeze-dried soil and air-dried soil using PMA, and the adaptive mechanism of viable microorganisms response to different soil archived strategies will be revealed. This study will provide a new theory and method for soil viable microbial study, and important references will be developed for soil archived strategies and their application in microbial ecology.

土壤微生物总DNA主要来源于胞外DNA以及活性和非活性微生物群，因此，单纯基于土壤微生物总DNA的研究无法反映出土壤中真实的活性微生物群，极易造成土壤微生物丰度及群落多样性的高估，但目前尚没有准确可行的方法筛选土壤活性微生物群。本项目拟利用PMA核酸染料具有共价不可逆结合膜受损的胞内DNA和游离DNA的技术特点，通过优化PMA预处理质量浓度、避光反应时间和曝光反应时间，建立适用于复杂土壤样品的实验操作流程；结合以RNA为核心的转录组学分析以及稳定性同位素示踪DNA-SIP技术，评价PMA用于复杂土壤样品活性微生物筛选的可行性和准确性；最后利用PMA筛选新鲜土、冷冻干燥土和自然风干土中活性微生物群，揭示活性微生物对不同土壤保存策略的适应机制。本项目的开展将为土壤活性微生物生态学研究提供新的理论和方法，同时为土壤样品保存策略及其微生物生态学中应用提供重要参考。

土壤微生物总DNA主要来源于游离DNA以及活性和非活性微生物群。因此，单纯基于土壤微生物总DNA的直接研究技术可能无法反映出土壤中真实的活性微生物群落结构及组成，极易造成微生物丰度及群落多样性的高估，急需建立有效可行的活性微生物筛选方法。本项目利用叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA)这类光敏性核酸染料筛选土壤中活性微生物群，确定了PMA处理土壤样品的实验条件和技术流程；PMA和DNA-SIP筛选法得到的活性功能微生物群落基本一致，且主要的甲烷氧化菌物种类型相同；尽管短期干燥处理降低了土壤细菌群落多样性，但自然风干土的活性功能菌及细菌群落与新鲜土壤的更为相似，干燥土壤中保留了95%以上的细菌门和属，relic DNA对整微生物群落的高估和低估仅占2%和1%。采用PMA对土壤relic DNA的去除恢复了保存7年的干燥土壤中13.3%的微生物多样性和4.27的物种转变率，且减缓了干燥土壤与新鲜土壤的微生物群落差异，干燥土壤中保留了90%的细菌门且细菌属对干燥压力具有不同的适应策略，长期土壤干燥保存没有显著的扰动施肥处理对微生物多样性、群落结构和抗性的遗留影响，长期干燥保存的土壤中细菌网络相比新鲜土壤具有较高的连通度和较短的连接路径，但去除干燥土壤relic DNA可改善细菌网络结构的拓扑属性。本项目研究结果一方面建立了适用于复杂土壤样品的活性微生物群筛选技术流程，评估了该方法的准确性和可行性；另一方面应用PMA法揭示活性微生物群对不同土壤保存策略的适应机制，为土壤样品保存策略、历史土壤的微生物资源挖掘及其应用于微生物生态学研究提供了重要参考。