纳川珠利对柔嫩艾美耳球虫作用的内生阶段、靶点以及机制的研究

Nitrozuril belongs to a new triazine anticoccidial compounds. Prophase research indicates that it has high efficiency and widespectrum of anticoccidial activity. The experiment done by the Department of Agriculturedrug safty evaluation qualification unit of Yangzhou University showed that It turns out good safty and quality of becoming a drug. Though Nitrozuril and Diclazuril are both triazine anticoccidial drugs, Nitrozuril keeps sensitive and high efficient activity to artifically induced resistance strains of Diclazuril. There is no inevitable cross resistance between each other. This study aims to find out causes and mechanism of this phenomenon. We plan to use the method of systematic analysis and comparison in growth,development, morphology and ultrastructure of Eimeria's after using Nitrozuril, and build chicken Eimeria internal and external infection model and analyze the proteomicsin different groups. Different protein properties will be analyzed by MS in order to find the speculated targets and mechanism of the Nitrozuril. This study contributes to discovering targets of new anticoccidial drugs and providing important theoretical and technical foundation to design new anticoccidial drugs. It also provides guidance of clinical reasonable application.

纳川珠利是全新结构三嗪类抗球虫化合物，前期研究证实其具有高效、广谱的抗球虫活性，委托农业部药物安全性评价资质单位扬州大学进行的相关临床前研究显示其安全性好，成药性基础扎实。纳川珠利与地克珠利虽然同属三嗪类抗球虫药物，但纳川珠利对人工诱导地克珠利耐药株保持敏感高效，相互之间没有"必然的"交叉耐药现象，究其原因和作用机理是本项研究的目的，本项目拟构建鸡球虫体内外感染模型，通过纳川珠利作用后柔嫩艾美耳球虫生长、发育过程、形态、超微结构变化的系统分析和比较，揭示纳川珠利作用于球虫的主要阶段和作用的细胞器，运用二维电泳等对主要作用阶段虫体进行蛋白组学分析，质谱检测差异蛋白属性，结合作用细胞器的功能蛋白信息，推测药物靶标和作用机理，并用体外抑制试验等分子生物学方法对靶标和作用机理进行验证，有助于发现抗球虫新靶标，为设计新抗球虫药提供理论基础和技术储备，为该药的临床合理用药提供指导，具有现实意义。

鸡球虫病是危害养禽业最严重的寄生虫病，临床主要依赖药物预防，因此，新药研究是球虫病有效控制的重要手段。纳川珠利是一个全新结构抗球虫化合物，但其抗球虫作用的基础、药物的作用峰期、作用部位和作用机制未知，严重影响药物的开发利用。本项目采用体内、外药物代谢模型，运用LC和LC/MS等分析方法，发现并鉴定了纳川珠利的3种代谢产物，其中主要是分子量为351的化合物（命名沙咪珠利），动物试验发现其同样具有高效、广谱的的抗球虫活性，是纳川珠利体内药效作用的主要物质基础之一，具有良好的开发前景；在药物作用峰期和部位研究方面，本项目采用在球虫生活史的不同阶段给药，通过抗球虫指标分析、组织病理学检查和超微结构分析，确定药物的主要作用阶段为裂殖生殖和配子生殖阶段，作用峰期为感染后3-4天，药物可引起虫体明显的外膜融合、内陷和外凸以及多种细胞器的异常，特征性的作用部位是虫体的膜性结构，此现象在同类药物的超微结构影响中未见报道，可能是与同类药物无交叉耐药的原因之一，具有相当的研究价值，本研究可为该药的临床合理用药提供指导，具有重要现实意义；在药物作用的分子机制方面，项目采用Label free蛋白组学技术，研究显示，纳川珠利和沙咪珠利作用后，E.tenella第二代裂殖子中显著性差异表达蛋白分别有115个和108个，进一步GO功能注释发现，对该类药物比较敏感的蛋白主要是大分子复合物、细胞器和细胞膜等，其中有较多的表面抗原，KEGG分析提示，其对氨基酸的合成，糖酵解和糖异生通路比较敏感。在此基础上，试验利用体外表达技术，选择性的对差异蛋白中表面抗原SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233)以及Enolase和LDH酶进行了药物影响的试验验证，结果表明，药物引起了mRNA水平和蛋白水平的表达量显著性下降，推测为可能的潜在药物作用靶标分子，本研究丰富了球虫的生物学信息，同时为此类蛋白的研究提供有益的借鉴，可为新型抗球虫药物的设计提供一定的理论基础。