Th17细胞中RORγt基因调控序列的鉴定

Th17 cells play a key role in tumorogenesis, transplantation, autoimmune diseases and viral infection. RORγt gene has been proven to be the sole phenotypic and functional marker of Th17 to date. Thus, the study on RORγt gene expression will provide the key data on clarification of the mechanism of many related diseases and the establishment of strategies to control these diseases. Up to date, there have been many reports on the function of RORγt protein on its downstream molecules. However, there is rare research on the regulation of the expression of RORγt gene itself, and the long range regulation(such as enhancers and silencers) of this gene expression is almost untouched by now. Although no relative report at present, the long range regulation of RORγt gene expression should be of great importance and the outcome of many gene expression is determined dramatically by this kind of regulation. Hence, in this study, we will focus on this field with epigenetic strategy. We will screen the candidate regulatory elements by ChIP-Sequencing methods, then validate the real function and spatial correlation of these candidates by Luc reporter system . The expected results from this study will explore the determinant factors about Th17 formation and provide important data to dissect the mechanism underlying Th17 function. Furthermore, the results themselves could be the targets to control many Th17-related diseases.

Th17细胞在感染和肿瘤等疾病中发生着非常重要的作用，RORγt为目前已确定的对Thl7细胞分化起决定性作用的特异性转录因子，因此对于RORγt基因的深入研究对于明确人体多种疾病发病机制及防治措施意义重大。目前对于RORγt基因下游功能研究比较多，但有关RORγt基因本身表达的调控研究还只是鉴定了该基因的启动子序列，对于调节启动子活性的更高级调控元件如增强子和沉默子的研究却未见报道，而后者对于基因在不同状态的细胞中的表达至关重要。因此本研究拟利用表观遗传学方法对Th17细胞基因组进行ChIP-Seq 扫描得到候选调节性序列，再利用pGL3-Luc报告系统、BAC-Luc报告系统对RORγt基因候选调节片断进行功能鉴定，筛选出真正调节性基因或片断。本研究有望找到Th17细胞形成的决定因素，为其作用机制的解码提供重要数据；且本研究结果本身也可能成为各种涉及到Th17细胞的疾病的潜在干预靶标。

Th17细胞在感染、自身免疫和肿瘤等疾病发生发展中起着非常重要的作用，RORγt是Thl7细胞分化过程起决定性作用的特异性转录因子，因此对RORγt基因的深入研究对于明确多种疾病的发病机制及防治措施意义重大。目前对于RORγt基因下游功能研究比较多，而在RORγt基因本身表达的调控研究方面，虽然已经鉴定了该基因的启动子序列，但对于调节RORγt启动子活性的更高级顺式作用元件如增强子和沉默子的研究却未见报道，而后者在细胞分化过程中发挥着至关重要的作用。本研究通过表观遗传学方法，利用增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2抗体，对Th17细胞基因组进行H3K4me2 ChIP-Seq 扫描，在Rorc基因上游发现一段3.4kb的候选增强子序列RORCE，ChIP-QPCR证实该序列同时发生了其它增强子活化相关的组蛋白修饰H3K4me1、H3K27ac和H3ac。为进一步确定候选增强子RORCE的功能和核心区，我们将RORCE分为三个1kb左右的片段RORCE1、RORCE2、RORCE3，分别克隆至pGL3报告质粒的RORγ/RORγt启动子上游，双荧光素酶报告系统检测结果表明RORCE2特异的对RORγt启动子活性有显著地增强作用。染色体构象捕获技术结合定量PCR检测的方法（3C-qPCR），在染色体水平上证实了RORCE2与RORγt启动子的相互作用。研究证实，CTCF转录因子特异的富集于增强子序列的两端以及启动子上游区域，我们通过CTCF的ChIP-seq数据分析证实，在表达RORγt的双阳性T淋巴细胞和Th17细胞基因组内，RORCE2序列两端以及RORγt启动子上游区域均富集有高丰度的CTCF，进一步证实该序列是调控RORγt表达的增强子。有研究报道Sox5通过与RORγt启动子相互作用调控其表达，我们在线预测了RORCE序列上转录因子Sox5的结合位点，并通过ChIP-qPCR进行了验证，推测Sox5促进了RORγt启动子和增强子loop环的形成。基于Th17与多种疾病的发生和发展有关以及RORγt基因在调控Th17细胞分化和功能上的重要性，本研究为 RORγt基因的表达调控分子机制和以后可能的临床应用提供更为详细的数据和理论指导；同时，研究所发现的RORγt特异性的增强子序列以及转录因子Sox5可以作为基于RORγt基因的新的Th17相关疾病的治疗靶点。