基于交汇调控炎症信号转导通路的大黄-黄芩"相使为用"配伍机制研究

As a traditional drug pair, Rhubarb and Scutellariae drug partner have been recorded in many ancient prescriptions, and they have property of eliminating heat and purging fire. In previous research, we proved that the drug pair of Rhubarb and Scutellariae showed the best anti-endotoxin and anti-inflammatory activities in drug pairs which were separated from Xie-Xin-Tang. Modern study of rhubarb and scutellariae showed that they inhibit key signaling proteins expression in LPS mediated inflammation pathway. The project is based on seven emotions theory, following the traditional Chinese medicine research thingking that combination of disease and syndrome, combination of drug and syndrome, unified principle and method with prescription, and puts forward the hypothesis that the drug partner of rhubarb and scutellariae have synergism due to its cascade amplification effect in LPS mediated phlogistic pathways.

大黄-黄芩为中药经典药对，古方多有记载，两者共奏清热泻火之功。课题组前期对泻心汤的拆方研究中发现该药对具有明显的抗内毒素和抗炎活性，且作用为诸药对之最。现代研究证实大黄、黄芩对LPS介导的炎症通路中关键信号蛋白有抑制作用。本项目以"七情配伍"之相使理论为指导，遵循中医病证结合、药证对应、理法方药统一的整体研究思路，提出"大黄-黄芩'相使为用'增效的分子机制是由于其在LPS介导的炎症通路上具有级联放大效应"的假说。拟采用巨噬细胞和内毒素血症大鼠模型，从整体、细胞、分子和基因水平，以各蛋白抑制剂对NO释放影响下，考察大黄-黄芩对LPS刺激巨噬细胞的TLR4、MAPK家族、IκBα和NF-κBp65蛋白表达的分级影响，以及对内毒素血症模型大鼠组织器官及血浆中相关受体蛋白表达的改变，从炎症通路分子水平的级联放大效应入手揭示大黄-黄芩"相使为用"增效的科学内涵，为中药配伍研究提供新的思路和方法。

本项目成功构建巨噬细胞以及内毒素血症大鼠炎症模型，并采用反向分子对接法，从整体、细胞、分子、基因上考察了大黄-黄芩对LPS刺激巨噬细胞的TLR-4、MAPK家族、IκBα和NF-κB p65蛋白表达的分级影响，以及内毒素血症模型大鼠肝肺组织以及血浆中受体蛋白表达改变的影响，并补充考察了黄连主要成分黄连碱对NF-κB、MAPK以及JAK/STAT 三条炎症通路靶位蛋白的作用，从炎症通路分子水平级联放大效应探讨了大黄-黄芩“相使为用”增效的科学内涵。. 研究发现，大黄、黄芩及大黄-黄芩药对（简称药对）对内毒素血症模型大鼠体温、胸腺系数、脾脏系数及肝肺W/D、肝肺含水百分比的降低作用；在LPS造模4h以及6h后，分别探究大黄、黄芩及药对对内毒素血症模型大鼠肝肺组织和血清中细胞因子（TNF-a、IL-1β、IL-6、NO）含量升高以及肝肺组织中TNF-a、IL-1β、IL-6、iNOs mRNA表达升高的影响，发现大黄-黄芩交汇调控以上靶点，抑制作用呈现浓度依赖性；研究表明大黄、黄芩及药对能降低内毒素血症模型大鼠肝肺组织中ERK、P38、IκBa、NF-κB P65磷酸化水平，同时大黄、黄芩还可以下调模型动物肝肺组织中TLR4蛋白和基因的表达；通过比较了大黄、黄芩及药对对TLR4-MAPK-NFκB炎症信号通路的影响，得出大黄、黄芩作用靶位高度重合，且作用强度各有所长，但药对并未呈现出显著的疗效叠加，“相使为用”体现出黄芩确为辅助作用，药对作用仍以大黄为主。补充实验证实黄连碱以及芦荟大黄素对LPS诱导的巨噬细胞TLR4、NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎症信号通路的激活以及对IFN-γ介导的巨噬细胞NO的产生均有抑制作用，并借助角叉菜胶诱导大鼠足肿胀模型验证；通过借助分子对接实验结果的通路权重分析，确定了芦荟大黄素、大黄酸、黄芩苷、黄芩素直接作用的靶蛋白为I型PI3Ks、IKKβ、iNOS、COX-2、JAK2、Akt1、p38。综上所述，动物以及细胞实验证实大黄黄芩交汇调控炎症通路靶位蛋白，可达到抗炎增效，但黄芩相使大黄作用未显著增强，抗炎方面以大黄作用为主；分子对接结果与实验结果叠合对比，虽大黄-黄芩抗炎作用靶位有一定重合，但“相使为用”体现亦不明显。实验补充拓展部分显示黄连主要成分黄连碱体内外均有较强抗炎效果，其作用靶位与大黄-黄芩成分重合度较高。