苹果树腐烂病菌FAE基因的克隆及其致病功能分析

Valsa canker, caused by Valsa mali Miyabe & Yamada, is one of the most destructive stem diseases of apple trees in China. And limited knowledge exists about the mechanisms of the fungal pathogenicity, which will impede to develop efficient management strategies to control apple valsa canker. Thus, obtaining knowledge about the interactions of pathogen-host at molecular level yields even greater insights into understanding pathogenic mechanism of Valsa mali. In previous studies, pathogenicity-less strains from ATMT mutant library established by our laboratory were selected through the pathogenicity assays. For this project, our first objective is to clone FAE gene by TAIL-PCR, then analyse FAE family gene by the blast of transcriptome sequencing data from Valsa mali. The expression analysis of FAE gene via RT-qPCR will aid to find the key FAE gene in the infection process. The pathogenitic function FAE gene of will be evaluated through gene knockout and functional complementation assay. By this project, we can expect a clearer understanding of the molesular basis of pathogenic mechanism of Valsa mali.

由Valsa mali 引起的苹果树腐烂病是我国苹果生产中的毁灭性病害，已经成为制约我国苹果安全生产的主要限制因子。由于对该病菌的致病机理缺乏系统研究，从而导致病害防治被动、盲目和低效。因此探索病菌与寄主互作的分子机制，从根本上揭示苹果树腐烂病菌致病机理具有重要的理论意义和实践价值。为此，本研究在前期工作的基础上，拟从苹果树腐烂病菌ATMT致病突变体入手，采用TAIL-PCR技术对阿魏酸酯酶（FAE）基因进行克隆，并结合苹果树腐烂病菌的转录组数据，利用生物信息学方法对FAE家族基因进行序列分析；再利用RT-qPCR技术分析FAE基因在病菌致病过程中的表达情况，从而筛选与致病相关的FAE家族成员；进而利用本实验室已经建立的PEG介导的遗传转化体系进行基因敲除和功能互补试验，鉴定该家族成员的致病功能，从而为解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础。

由Valsa mali引起的苹果树腐烂病是我国苹果生产中的毁灭性病害，已经成为制约我国苹果安全生产的主要限制因子。由于对该病菌的致病机理缺乏系统的研究，导致病害防治被动、盲目和低效。因此探索病原菌与寄主互作的分子机制，从根本上揭示苹果树腐烂病菌致病机理具有重要的理论意义和实践价值。本研究以前期从腐烂病菌ATMT文库中筛选获得的致病力降低突变体X912为基础，通过重测序分析认为其侧翼序列为阿魏酸酯酶B前体；结合病菌的基因组和转录组数据进行预测，利用Pfam等生物信息学数据库进行序列分析，并通过Mega 5.0构建蛋白进化树，确定腐烂病菌中的阿魏酸酯酶基因及其特征；利用荧光定量PCR分析该基因在腐烂病菌侵染寄主过程中的表达特征；进而通过基因敲除和互补及其致病性测定，明确该基因在病菌致病中的作用。取得的重要研究结果如下：（1）苹果树腐烂病菌基因组中共预测出7个阿魏酸酯酶基因，分别属于A、B、C和D四个不同类型，每个类型中的基因个数分别为1、1、3和2个；并且7个阿魏酸酯酶都含有信号肽切割位点，都没有跨膜结构域，其主要定位于胞外。（2）通过荧光定量PCR分析，发现阿魏酸酯酶基因在腐烂病菌侵染苹果树皮过程中，除VmFAEC3和VmFAED2外，其他5个基因均表现为显著上调表达，上调倍数在4.7~14.5之间。（3）采用PEG介导的遗传转化体系，获得了7个阿魏酸酯酶基因的敲除单突变体和回复突变体，进一步的生物学特性及致病力测定结果表明：获得的单基因敲除突变体的菌落生长速度、菌落形态及其分生孢子器形成与野生型菌株相比无明显差异；而VmFAEA1、VmFAEB1、VmFAEC1、VmFAEC2四个基因的单敲除突变体，其致病力较野生型菌株明显下降。（4）在获得的单基因敲除突变体基础上，进一步获得了VmFAEA1/ B1、VmFAEB1/ C1、VmFAEB1/ D1、VmFAEC1/ C2、VmFAEC1/ D1五个双基因敲除突变体，发现VmFAEA1/ B1、VmFAEC1/ C2、VmFAEC1/ D1三个双敲除突变体的致病力显著降低，其下降率分别达到23.2%、27.1%和32.4%。以上研究结果表明，苹果树腐烂病菌阿魏酸酯酶家族基因对病菌致病性具有重要作用。