SHH-TFs介导TBI反应性星形胶质细胞转分化为神经元的机制研究

Although astrocytes (AST) were converted into neurons to replace loss neurons after traumatic brain injury (TBI), the efficiency has been relatively low. We speculate that, compared with AST, reactive astrocytes (RAS) with pluripotent characteristics and re-expression of neural regeneration factors may be more ideal target of conversion. In this study, RAS is used to be the target cells of conversion. Nest, the SHH signal molecular Smo is regulated to explore the key pathway to breakthrough the glial restriction of RAS. And then, the expression profile of gene and ChiP sequencing are adopted to determine the core transcription factor, transcription factor group and precise interaction mechanism. At last, GFAP-transcription factors-Smo-EGFP lentivirus is constructed and injected into cortex penumbra of mice TBI model. The efficiency of direct conversion in vivo and function of induced neurons are evaluated. The aim of this study is to build a new method to harvest neurons with high efficiency and supply an important pathway of neural repair in vivo after TBI by clarifying the factors controlling the change of fine grading and gradual progress and the right step chain between factors.

尽管学者们尝试将星形胶质细胞（AST）转分化为神经元，以替代颅脑创伤（TBI）丢失的神经元，但转分化的效率一直较为低下。TBI形成的“反应性AST”（RAS）具有多能特征且重新表达神经再生因子，可为转分化提供更高的“起点”。由此推测，相对于AST，RAS可能是转分化更理想的靶细胞。本课题拟以RAS为转分化靶细胞，通过调控SHH信号通路关键分子Smo，探讨突破RAS胶质属性限制的关键通路；通过基因表达谱测序和ChiP-seq确定核心转录因子（TFs）、有效TFs群及精准的相互配合机制；构建GFAP-TFs-Smo-EGFP慢病毒，注射小鼠TBI模型半暗带，评估“在体直接转分化”的效率和转分化神经元的功能。本课题通过确立控制转分化精细分级和循序渐进变化的因素，及各因素之间正确的“步骤链”，以建立“在体”高效获得神经元的新方法，为实现TBI神经功能修复提供一条重要途径。

颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）后神经功能修复仍无有效的治疗措施，神经元的“不可再生性”是制约神经功能重建的关键。转分化技术可将TBI后的反应性星形胶质细胞（reactive astrocytes，RAS）转分化为神经元，以替代TBI丢失的神经元，但转分化的效率一直较为低下。TBI形成的“反应性AST”（RAS）具有多能特征且重新表达神经再生因子，可为转分化提供更高的“起点”。由此推测，相对于AST，RAS可能是转分化更理想的靶细胞。本课题拟以RAS为靶细胞，通过制备两种不同类型RAS，检测其RAS中基因表达的差异与损伤类型的相关性；评估知母皂苷元介导SHH信号通路作用于不同类型的反应性星形胶质细胞获得神经干细胞潜能的作用；行为学检测SAR介导SHH信号通路对损伤大鼠的空间探索能力和记忆能力的影响。结果显示，炎症组RAS中A1型反应性星形胶质细胞的特异性基因明显增多，而划痕组RAS中A1s相关基因表达无明显改变；SHH信号通路激活剂SAG可使AS组神经干细胞相关基因Nestin、Pax 6、Sox 2、Oct 4和Map 2表达趋势均升高，其中划痕组增高更为显著。SHH信号通路抑制剂cyclopamine可使RAS组细胞中各基因表达显著降低；行为学实验结果显示RAS组给予SHH信号通路激活剂SAG后，逃避潜伏期缩短，平台穿越次数及目标象限停留时间均增加。本课题通过提体内和体外实验，探讨知母皂苷介导SHH信号通路对不同损伤类型RAS表达神经干细胞相关基因表达的影响，为提高RAS转分化为神经元效率，建立“转分化”高效获得神经元的新方法，实现TBI神经功能修复提供一条重要途径。