牡丹类黄酮甲基化酶基因（FOMT）表达模式及作用机制研究

牡丹是集观赏和药用于一身的我国特色资源植物，其花中含有多种甲基化的色素，是研究花青素和类黄酮甲基化酶基因（FOMTs）的理想材料。本研究在牡丹花芽cDNA文库构建基础上，根据牡丹不同花色品种和花瓣斑与非斑部分之间色素甲基化差异明显的特点，利用荧光定量PCR研究牡丹FOMTs在花色形成的时间、空间上的表达模式，进而分析不同品种、不同花色部分的FOMTs表达情况。并将牡丹FOMTs进行原核、真核表达研究，转化E.coli，纯化蛋白进行酶促反应，鉴定活性和底物特征；转化烟草及牡丹，研究转基因烟草的表型和色素组成及牡丹花蕾的瞬时表达情况。探讨FOMTs在类黄酮代谢途径中的修饰机制，在分子水平上阐明牡丹花色形成机理，为牡丹花色的分子育种及类黄酮代谢途径调控提供科学依据。甲基化酶功能是目前国际研究热点之一，在理论和应用方面都具有重要的学术和应用价值。

牡丹不同花色品种和同一品种的花瓣斑与非斑之间类黄酮色素甲基化差异明显，暗示着牡丹是研究类黄酮色素甲基转移酶的作用机制及其对花色影响的理想材料。申请人从富含甲基化类黄酮的紫色花品种‘群芳殿’（Paeonia suffruticosa ‘Gunpohden’）中克隆得到牡丹类黄酮甲基转移酶候选基因PsFOMT。经异源表达蛋白体外活性鉴定和酶动力学研究，证明PsFOMT是II型亚类甲基转移酶，催化具有B环邻二羟基和C环3-羟基的类黄酮底物，最佳底物为矢车菊素苷。同时，申请人从甲基化程度较低的红色花近缘种细叶芍药（Paeonia tenuifolia）中克隆得到同源基因PtFOMT，其推定的氨基酸序列与PsFOMT只有四个位点的差异，而其活性只有PsFOMT的60分之一，经点突变实验证明，活性的差异是由87位单个氨基酸的突变所导致。PsFOMT和PtFOMT在植物体内的功能也由转基因烟草和转基因草莓实验所证实。牡丹PsFOMT在不同发育阶段的花瓣和根茎叶中的表达分析，结合类黄酮的积累情况，表明PsFOMT在牡丹花青苷甲基化过程中发挥主要作用。对转基因烟草花瓣的色彩进行分析，表明过表达PsFOMT的烟草花色显著向紫色偏移。这一结果结合牡丹花色及类黄酮组成分析，揭示了甲基化导致牡丹花色的紫色化。本研究阐述了花青苷合成的下游甲基化修饰途径，并解析了牡丹花紫色化的分子机制，为牡丹花色调控和花色育种开辟了一条新途径，并应用于牡丹起源研究、黑牡丹育种以及黑米、葡萄、蓝莓等的优质高含量花青素苷新品种选育等方面。