天蓝色链霉菌中一种DNA硫化修饰依赖型限制系统的发现和功能研究

变铅青链霉菌dnd基因簇编码的蛋白可以将DNA双链特异位点的磷酸二酯键骨架上的P-OH变成P-SH，从而导致DNA在电泳过程中降解；本研究前期发现：DNA磷硫酰化修饰后，在体内可以被近缘的天蓝色链霉菌限制进入，限制的频率至少可以达到1000倍以上，通过生物信息学分析和缺失突变分析，一个可以自发环出的基因组岛编码了这种修饰依赖型的限制系统，有别于所有以前发现的IV型限制系统的是：这是第一例限制DNA骨架修饰而非碱基上修饰。我们将对这个基因组岛上的可能的限制蛋白进行敲除，异源表达并观察对硫化修饰DNA限制性的影响；在大肠杆菌中表达纯化蛋白，鉴定其识别和生化切割位点，并比较其在电泳条件下化学切割的异同；最后，对这个蛋白进行结晶，以期对其结构进行解析，为其功能提供理论上的证据。

模式链霉菌天蓝色链霉菌M145不仅对不同类型的甲基化DNA具有很强的限制性，本研究发现它对新型的DNA磷硫酰化修饰限制也很强。通过比较基因组学的研究发现，一个16.9kb的基因岛上的基因sco4631被敲除之后，突变株不再限制磷硫酰化DNA。在大肠杆菌中表达该蛋白，纯化后的蛋白不仅可以切割磷硫酰化的DNA，同时还可以切割被Dcm修饰过的DNA，但是这种切割需要Mn2+存在。后一种活性通过体内试验也得到了验证。通过footprinting试验，我们鉴定了该蛋白识别甲基化和磷硫酰化DNA的优先位点，同时，通过末端克隆鉴定了这个异常限制酶切割这两种类型修饰DNA的精确位点,相关工作发表在2010年12月《PLoS Genetics》上。审稿人称这是一个开创新时代的 (epoch-making)发现。目前，Sco4631晶体已经拿到，但是，多次X-光衍射图的分辨率都在3埃以上，目前还没有办法对其结构进行解析，后续工作正在努力进行。