植物组织培养中愈伤组织启动或维持的功能基因鉴定

在组织培养过程中，植物细胞发挥自身潜在的全能性，能够通过脱分化和再分化形成完整的植株。而在这个过程中，生长素/细胞分裂素对于细胞全能性的发挥起着非常重要的调控作用。然而迄今为止，关于细胞脱分化和分化的分子机理仍不清楚。我们将利用诱导型激活标签转化拟南芥根外植体获得转化群体，在无外源生长素的培养基上，筛选不依赖于生长素的愈伤形成和维持突变体，克隆候选的功能基因，并重新构建转回拟南芥确认其在愈伤组织发生或维持中的功能。进而通过microarray和酵母双杂确定与其相关的信号分子或基因，确定具体参与的信号通路，试图解析该功能基因启动或维持愈伤的分子机制，探索其在脱分化过程中与生长素信号可能的关系。该项目对揭示分化的植物细胞如何完成脱分化进而启动愈伤和维持生长的规律具有重要的意义，为研究植物组织培养中植物细胞全能性的获得机理提供新的思路。

植物的组织或器官在一定的培养条件下，能够再生出新的器官或完整植株。半个多世纪以来，植物离体再生体系已经成为植物生物技术发展的重要平台。愈伤组织的诱导是高度分化的植物细胞在适当的培养条件下获得多能性的过程，是离体再生过程中的关键步骤。然而迄今为止对于愈伤形成或维持的分子机理仍不清楚。为了鉴定这个过程中的关键因子，我们通过建立一个稳定的拟南芥根转化系统获得正向的愈伤突变体和通过反向遗传学分析拟南芥愈伤形成过程的转录表达谱并从中挑选高度上调的22个基因过表达来寻找在愈伤起始或维持过程中的重要基因。结果如下：.1、建立了一个稳定的根转化筛选系统，并通过其获得了一些重要的不依赖生长素的正向愈伤突变体。.2、通过对拟南芥愈伤起始过程的全基因组表达谱分析，检测到愈伤诱导初期能够迅速激活生长素信号途径，许多转录因子被诱导上调表达；在诱导的后期，一些参与调控细胞状态以及参与表观遗传修饰的因子被上调，如：周转蛋白、磷酸转移酶、组蛋白和DNA修饰的组分等。这些基因的上调表达能够改变细胞的状态，最终促使细胞获得多能性进行细胞分裂以及促使愈伤的形成。.3、发现4个编码植物特有转录因子的基因LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）/ASYMMETRIC LEAVES2-LIKE（ASL）在愈伤起始过程中被显著诱导。过表达4个LBD基因的转基因植株无论是活体或离体均可以在无外源激素条件下表现出不同程度的自主愈伤发生表型。而LBD16 T-DNA插入突变体lbd16-2和Pro35S:LBD16:SRDX转基因植株表现出愈伤形成的部分缺陷。结果表明，LBD基因是控制植物愈伤组织形成的关键因子。进一步的研究表明LBD并非通过增加转基因植株中生长素的合成或局部积累来促进愈伤形成，而是可能参与生长素信号途径介导该过程。过表达LBD16或LBD29诱导形成的愈伤与CIM诱导的愈伤具有相似的特性，即根分生组织特异表达基因PLT1、WOX5在愈伤组织中大量积累表达。此外，LBD位于ARF下游介导愈伤形成。. 这些结果为寻找和鉴定参与拟南芥愈伤起始过程的重要因子提供了参考依据。另外，本研究发现了4个LBD基因作为调控愈伤起始的关键因子，作用于ARF下游介导由生长素诱导的愈伤形成，从而揭示了生长素诱导愈伤形成的初步的分子机理。