海岛棉纤维强度相关基因的克隆与功能研究

海岛棉具有优良的纤维品质，发掘其纤维品质形成相关基因及其调控元件在分子育种中非常重要。纤维强度是目前纤维品质改良的重要目标之一，主要由纤维次生壁发育所决定。在前期研究中，我们在棉花上使用纤维发育次生壁加厚期转录组图谱QTL定位，得到两个棉纤维强度QTL（表型贡献率分别为16.08 % 和 15.87 %），与其共分离的6个来自海岛棉的TDF（Transcript-derived fragment）对应的苯丙氨酸解氨酶和磷脂酰肌醇激酶等6个基因被认为是纤维强度有关的候选基因。本研究拟以转录组图谱QTL定位获得的候选基因TDF为基础，从海岛棉和陆地棉中克隆相关基因，分析其在两个棉种中的结构差异以及在棉纤维次生壁加厚期的表达差异动态，通过开发新的分子标记重新定位和模式植物遗传转化分析其功能，为研究相关基因对次生壁发育的作用提供分子证据，为改良棉纤维强度提供新的基因资源。

在前期研究中，使用纤维转录组图谱QTL定位，得到两个棉纤维强度QTL，与其共分离的6个来自海岛棉的转录分离片段（TDF）所对应的基因被认为是纤维强度有关的候选基因。本课题的目的在于克隆相关基因并分析其功能，取得了相应的研究结果。利用电子克隆、RACE和Genome Walking技术相结合，获得了纤维强度候选基因序列，明确了基因编码产物，即磷脂酰肌醇-4-激酶（PI4K）、海藻糖6-磷酸合成酶（TPS）、类成束-阿拉伯糖蛋白5（FLA5）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、类纤维素合成酶（CslG）和转录因子MADS4。对各基因在调节纤维次生壁加厚（SCW）和纤维强度中的作用开展了针对性的研究。通过海岛棉和陆地棉间序列比较和基因表达分析，证实PI4K、TPS、PAL和FLA5在纤维发育SCW期特异表达而起重要的调节作用，并在海陆种间主要存在与纤维强度形成相关的反式（Trans）调控差异。推测GbPI4K可能经过Rac蛋白调节磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol）信号通路而起作用，并通过亚细胞定位分析明确了GbPI4K在膜上起作用。结合基因表达分析和与41种植物FLA蛋白的进化分析认为FLA5属于A亚类的阿拉伯糖蛋白，是植物细胞壁SCW发育的特异表达壁蛋白，可能通过调节纤维素的沉积而影响纤维强度。遗传转化结果说明，与野生型相比，转正义GbPI4K和GbTPS基因的拟南芥表型差异不大，而转反义GbPI4K拟南芥生长缓慢，茎杆断裂强度显著变小，根长变短，叶片变小；转反义GbTPS基因的拟南芥发育异常。GbPI4K转化陆地棉的结果说明，纤维长度和强度发生显著改变，但在品种间差异较大（如冀棉20和Coker 312）。通过基因标记开发和QTLs定位的结果说明，PI4K和TPS基因本身的序列差异不是决定海岛棉和陆地棉间纤维强度差异的关键。通过标记与性状的关联研究获得了4个纤维品质性状显著相关的4个AFLP位点，并通过QTL元分析获得1个与纤维强度性状相关的一致性QTL。研究结果对于了解棉纤维发育过程中的基因表达与调控机制，次生壁加厚的分子机理，以及纤维强度分子改良相关基因资源的发掘具有重要意义。