嗜水气单胞菌Crispr-cas系统内源性调控自身毒力基因表达的机制

The regulation of virulence gene expression is crucial for Aeromonas hydrophila's host invading. At the early stage of invading, the expression of bacterial lipoproteins(BLPs) was down regulated, as the BLPs were recognized by one pattern recognition receptor(PRR), Toll-like receptor2(TLR2), so it dampen TLR2 activation and evades host defences. Our previous dates showed that the expression of BLP was related with a Crispr-cas system in a newly isolated field strain of Aeromonas hydrophila, according to the mechanism of the action of Crispr-cas system. we propose that it utilizes unique, small RNAs to recognize endogenous transcripts encoding bacteria lopoprotein, and conserved Cas proteins to mediate target degradation, so the bacteria could reach its replicative destination without significantly inducing proinflammatory cytokines, thus promote its pathogenesis. To test this hypothesis, the structure of the bacterium's Crispr-cas system and the sequences of crRNA and other functional small RNAs will be constructed to analyze the expression patterns of BLPs in vitro and in vivo. Meanwhile, carp will be challenged with the field or mutant types of Aeromonas hydrophila to investigate whether the expression of BLPs is involved in the bacteria pathogenesis. These studies could help us better understanding the roles of Crispr-cas system in the bacterial survival and pathogenesis, and provide us a new perspective to investigate the regulation of virulence genes in Aeromonas hydrophila.

嗜水气单胞菌在侵入宿主时，毒力基因的表达调控是致病性的关键。其中细菌表面脂蛋白可被宿主TLR2识别并激活其天然免疫系统，在感染初期，细菌可下调脂蛋白的表达以降低免疫系统的攻击。我们在新分离的一株野生型嗜水气单胞菌中发现其脂蛋白的表达受到该菌的Crispr-cas系统的调控，根据Crispr-cas系统的工作原理，我们推测其通过特定序列的小RNA结合脂蛋白的转录子，由cas蛋白降解以抑制其表达，以此减弱宿主促炎细胞因子的释放，从而增强细菌的毒力。为验证此假说，本研究拟通过基因克隆、生物信息学分析获得该菌Crispr-cas系统的结构信息以及crRNA和其他功能性小RNA序列；通过制备cas蛋白、各类小RNA的突变菌株以及突变株生长和感染实验，分析其调节脂蛋白表达的作用机制。本研究有助于理解Crispr-cas系统在细菌生存和致病中的作用，并为探究嗜水气单胞菌毒力基因的表达调控提供了新的角度。

为深入研究嗜水气单胞菌病原相关分子模式脂蛋白的表达调控及其致病机制，项目分离鉴定了嗜水气单胞菌野生株JC529，采用离心分离硫酸铵沉淀技术和离子交换层析纯化，获得纯化的鞭毛蛋白，并重组表达了鞭毛蛋白FlaA与FlaB。应用Rea l-Time PCR检测头肾中TLR5M、TRAF6、TNF-α mRNA表达量的差异，证实重组鞭毛蛋白能够调节鲤鱼TLR5M及其信号通路中相关因子，产生免疫应答，为分析细菌致病性提供了新的手段。利用小鼠接种实验验证了新分离菌株的毒力及对小鼠的致病性。相关研究对气单胞菌疫苗开发以及鱼类免疫应答状态检测有潜在的应用价值。对课题组分离的嗜水气单胞菌JC529株进行了全基因组测序和分析, 利用生物信息学手段对Crispr-cas系统结构特征和序列组成进行了分析。即组装出细菌基因组中完整序列（染色体及质粒序列信息），可用于病原菌致病相关基因鉴定，种内进化关系研究，工程菌的改造，遗传理论模式生物研究等方面。通过全基因组测序，对嗜水气单胞菌JC529株的基因背景有了充分的了解，获得了CRISPR系统信息，分析发现其有自身的特殊性，未见含有cas9蛋白的编辑体系，分析其对脂蛋白等致病毒力因子的调控有其自身的机制。针对嗜水气单胞菌脂蛋白设计并构建重组自杀性载体PRE112-ud Lpp，筛选出缺失脂蛋白基因的同源重组菌株ΔLpp。同时以JC529单基因缺失株ΔLpp1为受体菌构建了双基因缺失株ΔLpp/LppB。通过传代培养验证其遗传稳定性良好。构建的嗜水气单胞菌脂蛋白单基因和双基因缺失突变株和互补株可用于研究脂蛋白在细菌侵入、定植以及诱导宿主免疫应答中的作用，为研究嗜水气单胞菌自身CRISPR系统调控脂蛋白表达影响细菌致病性的机制奠定了基础。