荔枝采后褐变关键酶基因的克隆与表达分析

主要由酶促褐变引起的果皮采后褐变严重降低了荔枝果实的商品价值，是限制荔枝产业发展的主要瓶颈问题之一。多酚氧化酶（PPO）是引起果皮酶促褐变的关键酶。本项目拟克隆荔枝PPO基因全长cDNA及其相应的基因组序列，研究这些基因的时空表达特征，寻找果皮表达PPO基因及其在褐变潜力不同品种间的序列差异，分析PPO活性与基因序列及果皮褐变之间的关系；研究PPO基因在果实发育不同阶段及采后不同处理的果皮中表达、分布变化，分析这些变化与酶活性变化及果皮褐变的关系；同时，克隆果皮PPO基因启动子，分析其结构特征，寻找其核心调控元件，研究启动子在不同处理条件下的调节活性变化及其与PPO表达、酶活性变化和果皮褐变的关系。研究结果将从多层次揭示PPO与果皮褐变的关系，为通过基因工程或其它技术抑制PPO活性来控制果皮褐变提供基础。

采后荔枝果皮快速褐变是制约荔枝产业发展的重要因素之一，酶促褐变是主要原因,多酚氧化酶（PPO）在酶促褐变中起关键作用，其分子机制尚不明确。揭示荔枝PPO基因表达与果皮褐变之间的关系，可望为从分子水平控制采后荔枝褐变提供基础与依据。.本研究首先比较了6个荔枝品种的耐贮性。室温下紫娘喜果皮褐变最慢，最耐贮藏，妃子笑次之，南岛无核荔枝褐变最快，最不耐贮藏。果实贮藏前期，果皮中PPO结合态、游离态与总酶活性以无核荔枝最高，妃子笑次之，紫娘喜最低。新采收果实中，紫娘喜果皮PPO同工酶仅2条带，妃子笑3条，无核荔枝有4条。耐贮的紫娘喜果皮MDA含量、质膜透性及LOX活性较不耐贮的无核荔枝要低，GR活性前者比后者高。.妃子笑PPO基因（LcPPO） cDNA序列全长2120 bp，其中开放阅读框（ORF）长1800 bp，编码598个氨基酸残基的多肽，DNA序列含一个215 bp的内含子。Southern杂交表明LcPPO可能为双拷贝基因。紫娘喜、妃子笑、南岛无核荔枝LcPPO对应的ORF序列存在36处SNP，内含子序列中也存在7处SNP和2个插入/缺失变化。.定量PCR结果表明LcPPO在果肉中表达量最低，花中表达量最高。在荔枝果皮发育过程中LcPPO表达低而稳定，但采后表达量剧烈上升。不同品种、不同采后处理条件下果皮LcPPO表达变化与PPO活性变化规律一致，均先上升后下降。室温下南岛无核果皮褐变指数最高，采后2d内PPO活性最高，LcPPO表达量也最高；‘紫娘喜’褐变指数最低，采后2d内PPO活性和LcPPO表达量都最低。0.2μm 保鲜袋包装贮藏降低了‘妃子笑’果皮失水量，延缓了果皮褐变，也降低了采后3d内果皮PPO活性与LcPPO表达。4 ℃贮藏也延缓了妃子笑果皮褐变，同时降低了采后2d内果皮PPO活性与LcPPO表达。这表明，PPO活性受LcPPO表达影响，采后贮藏前期果皮中LcPPO上调表达可能提高了果皮PPO活性，对采后果皮褐变起促进作用。.获得了LcPPO的部分启动子序列。妃子笑、南岛无核、紫娘喜三品种PPO启动子序列存在22处SNP和2处碱基插入/缺失。单侧序列缺失实验表明，不同长度启动子片段均能介导GUS基因在果皮和叶片中表达，但不能介导GUS基因在种子中表达。.本研究为进一步研究PPO与果皮褐变的关系及通过控制LcPPO表达抑制采后果皮褐变提供了坚实基础。