调控家蚕发育非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）的功能解析

课题组在前期研究家蚕50-500nt非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）过程中，发现40个新的ncRNA参与家蚕发育调控。为进一步研究这些ncRNA的功能，本研究拟采用Northern 杂交分析40个新的ncRNA在家蚕不同组织中的表达模式。用40个ncRNA作为探针制备Biacore芯片，提取家蚕主要发育阶段（胚胎期、幼虫期、蛹期和成虫期）总蛋白，利用Biacore 3000实时分析ncRNA和蛋白之间的相互作用。筛选与ncRNA互作的蛋白质，质谱分析鉴定其组成和种类。同时采用免疫共沉淀技术证实这些蛋白质和ncRNA的特异相互作用。收集实验数据，构建调控家蚕发育的ncRNA与蛋白质互作的数据库。结合ncRNA的组织特异性表达模式，解析ncRNA与蛋白质相互作用对家蚕发育的分子调控机制。

课题组在前期构建家蚕50-500nt非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）文库中，发现40个新的ncRNA可能参与家蚕发育调控。为进一步研究这些ncRNA的功能，本研究采用Northern 杂交和荧光定量PCR研究40个ncRNA在家蚕不同组织中的表达模式，同时对部分ncRNA的功能进行了探索。结果发现，40个差异表达的ncRNA在家蚕不同发育阶段大都呈组成型表达。但在家蚕5龄幼虫不同组织中研究发现，11个ncRNA在丝腺中富集，其中4个ncRNA（Bm-51、Bm-152、Bm-159和Bm-163）在丝腺中存在特异表达。进一步分析ncRNAs在丝腺不同部位的表达情况，发现4个ncRNA（Bm-51、Bm-100、Bm-102和Bm-163）在前丝腺富集，其中Bm-102在后丝腺不表达；而另外3个ncRNA（Bm-101、Bm-152和Bm-159）在后丝腺富集。对部分丝腺富集的ncRNA的结合蛋白进行研究发现，Bm-102和Bm-159可能通过组蛋白复合体参与丝腺发育；另外Bm-152可能通过与snoRNA蛋白复合体相互作用来调控其互补链基因的表达；个体中过表达Bm-152促进家蚕5龄龄期缩短，促使家蚕提前上蔟。同时，我们发现部分ncRNA能够在幼虫不同生殖器官富集，其中12个ncRNA在精巢中高表达，包括5个snoRNA和7个不能归类的ncRNA，且大部分snoRNA为孤儿snoRNA，没有预测的靶标基因。其中的Bm-51、Bm-68和Bm-163在精巢中的表达量远高于卵巢，尤其是Bm-68，在精巢中表达量为卵巢中的11倍，个体瞬时转基因结果显示，雌虫中过表达精巢富集的 Bm-68会诱导dsxM上调。另外4个ncRNA（Bm-86、Bm-100、Bm-101和Bm-170）在卵巢中高表达。个体瞬时过表达卵巢富集ncRNA Bm-86会诱导dsxF：dsxM比例上调，表明Bm-68和Bm-86可能参与家蚕性别的发育调控。本研究对家蚕50-500nt ncRNA的时空表达谱进行了系统的研究；并通过垂钓与ncRNA互作的蛋白发现了部分ncRNA可能通过蛋白质复合体参与家蚕发育；同时通过个体的转基因实验发现部分ncRNA可能在家蚕丝腺发育及性别决定中发挥重要调控功能。本研究从非编码RNA角度为探索家蚕发育的分子调控机制开拓了新的思路。