层析介质孔结构的原位表征和蛋白质的吸附保留

蛋白质层析介质的孔结构特征对蛋白质分离纯化过程有着重要影响。本项目提出了一种原位表征孔结构的新方法，即采用反向尺寸排阻色谱（ISEC），在实际层析过程完全相同的条件下，用多角度激光光散射（MALLS）和动态激光散射检测器（DLS）在线测定洗脱液中溶质的分子尺寸，根据不同分子尺寸的溶质在层析柱上的分配系数与介质孔径之间的相互关系，得到介质的孔径分布、平均孔径、相比等结构参数。通过改变操作温度、流动相的pH、离子强度等操作条件，准确获得这些条件变化对介质孔结构造成的影响，研究不同操作条件下的介质孔结构的变化规律。将上述获得的这些孔结构参数与胶体等温模型、孔扩散模型和非线性层析模型等相结合，探索介质的孔结构变化对蛋白质吸附和保留行为的影响，从而可以为深入了解蛋白质吸附保留提供机理指导，为蛋白质层析过程提供理论基础。

本项目利用逆体积排阻色谱-在线分子尺寸检测、激光共聚焦显微镜、低场核磁共振探索了层析介质孔结构的原位表征和对蛋白质的吸附保留的影响。.首先我们研制了蛋白层析介质自动化合成装置，用于研究中所需介质的合成，得到孔径可控的样品用于后续研究，解决了目前装置的自动控制、反应釜控温和介质固化，介质洗涤等难点。进一步为了解决层析系统与在线分子尺寸检测器之间控制模式和数据传输兼容、触发延迟等问题，我们研制了多柱组合层析系统，并进行了各种层析模式和层析工艺的测试，实现了完全自主的控制、数据记录和处理，解决原位表征时可能存在的层析柱长不够而无法获得完整的吸附保留数据的问题；同时可实现多根柱子同时运行，避免层析柱拆卸和更换造成的实验重复性较差。.在上述工作基础上，构建了凝胶渗透色谱GFC和和在线分子尺寸检测器Triple Detector（激光检测器、示差检测器和粘度检测器）联用分析装置，通过对商品层析介质的测定，研究了不同探针对测定结果的影响，获得了不同分子量的探针分子尺寸和保留体积的关系，同时也发现了在逆体积排阻色谱中分子尺寸和保留体积存在不符合体积排阻规律的关系。因此我们利用蛋白层析介质自动化合成装置我们制备了平均孔径约为20nm和40nm的交联琼脂糖，进行了激光共聚焦显微镜检测，结合破伤风类毒素、乙肝免疫球蛋白、狂犬病疫苗等不同尺寸的蛋白质，测定了孔径对蛋白吸附保留的影响，并通过上述检测手段对介质的合成进行了调控，对介质表面配基的密度和肩臂长度进行了设计，研究了对层析纯化效果的影响，通过对介质孔径，表面配基密度和肩臂长度的有效控制，获得了更高的纯化倍数。.最后进行了低场核磁共振测定层析介质孔结构的探索，研究了大量的商品介质样本，同时利用层析介质自动化合成装置，制备了部分不同孔径的介质进行对比和测试。研究确定了层析介质孔内水、介质之间间隙水和自由水在低场核磁谱图上的峰归属；将测定结果与你体积排阻法的结果进行了对比，得到了良好的线性关系；最后通过高斯正态拟合得到介质相应的孔径分布图，初步研究分析了介质交联、配基键合前后结构的变化。