Ca2+激活氯离子通道在轮状病毒腹泻病理生理机制中的作用

Rotavirus is the leading cause of severe secretory diarrhea in infants and young children worldwide, resulting in an estimated 0.5 million deaths annually in children under 5 years. The pathophysiological mechanisms of rotavirus-induced lethal intestinal fluid loss remain unclear. Our preliminary data recently reported in Gut, and earlier findings, implicate intestinal Ca2+-activated chloride channels (CaCCs) as the major rate-limiting step in rotaviral diarrhea and indicate that their inhibition should greatly reduce the volume of secreted fluid without affecting the infectious process. However, the types of involved CaCCs, the mechanisms of action and their contribution in intestinal fluid net secretion remain unresolved. Current knoeledge suggested that rotavirus enterotoxin may induce Cl- secretion through different types of epithelial CaCCs to increase fluid secretion and enhance intestinal motility through activating TMEM16A on interstitial cells of Cajal (ICC). This proposal will utilize selective CaCC inhibitors identified in our previous work to dissect the role of different CaCCs in virus-induced epithelial fluid secretion and smooth muscle contraction. Our study will expand the knowledge of the molecular mechanisms of rotaviral diarrhea and provide new insights into novel antisecretory and antimotility therapies for this infectious disease.

轮状病毒引起的严重分泌性腹泻每年造成全球约50万5岁以下儿童死亡，致死的主要原因是短时间内肠道大量液体和电解质丢失，其病理生理机制目前尚未阐明。前期研究提示钙激活氯离子通道（CaCC）可能在轮状病毒激发的肠道上皮Cl-大量分泌（液体分泌增加）和Cajal细胞介导的肠动力增强（液体吸收减少）两方面发挥重要作用。我们在前期研究中发现，应用CaCC抑制剂进行的抗分泌治疗能够阻断轮状病毒引起的肠道液体分泌而不影响病毒感染过程，支持CaCC在轮状病毒腹泻机制中发挥关键作用的观点。然而所涉及的CaCC类型、作用机制和在肠道液体净分泌中的贡献目前尚不明确。本项目拟在前期工作基础上，利用针对不同类型肠道CaCC的选择性抑制剂在体内、体外模型上系统研究不同类型肠道CaCC在液体分泌和肠动力调控机制中的作用以及在轮状病毒腹泻肠道液体净分泌中的贡献，为轮状病毒腹泻的抗分泌和抗肠动力治疗策略提供理论基础。

本项目按照计划书执行，完成了计划要点的全部内容。明确了Ca2+激活氯离子通道在轮状病毒腹泻病理生理机制中的作用，明确了几种氯离子通道在肠道液体分泌和肠动力调节中的作用：（1）证实肠上皮存在与TMEM16A分子身份与电生理特性不同的CaCC亚型（肠上皮CaCC，CaCCgie），发现该亚型的电生理特征与TMEM16A明显不同，短路电流测定中TMEM16A表现为持续电流，而CaCCgie表现为瞬时电流（测定条件下该电流在2 min之内迅速衰减）。两种CaCCs在肠上皮的分布不同，表现为从回肠到结肠近端再到结肠远端TMEM16A的表达依次显著提高，而CaCCgie介导的短路电流强度依次降低。（2）轮状病毒导致的肠道液体大量分泌主要是通过激活CaCCgie实现的，药理学抑制该通道活性能够有效地预防和治疗轮状病毒腹泻，CaCCgie在肠道液体吸收中没有显著作用。（3）TMEM16A在肠道Cajal细胞高表达，在轮状病毒腹泻机制中TMEM16A激活主要通过促进肠蠕动抑制肠内液体的吸收造成液体流失；药理学抑制TMEM16A通道活性能够抑制小鼠肠道平滑肌收缩和肠动力从而增强肠道液体吸收并最终减轻轮状病毒导致的腹泻；急性便秘小鼠结肠各肌层TMEM16A表达量均显著降低，从而导致肠蠕动减弱和液体吸收增强；TMEM16A对肠上皮液体分泌贡献较小。（4）概念验证性实验证实了选择性激活CFTR氯离子通道能够完全逆转便秘模型小鼠的便秘症状。上述研究结论总结在图1中。综上，本项目利用小分子选择性探针发现了一种新型钙激活氯离子通道CaCCgie，明确了不同类型CaCCs在轮状病毒腹泻病理机制中的作用。研究成果不但对于明确CaCCs在轮状病毒导致肠道液体过度分泌机制中的作用以及肠道Cajal细胞TMEM16A在轮状病毒腹泻肠动力调控机制中的作用具有重要的理论意义，而且对于轮状病毒腹泻的抗分泌和抗肠动力治疗策略提供理论指导。研究成果延伸至调控不同类型肠道氯离子通道在肠道液体分泌失衡导致腹泻和便秘两方面的治疗作用。此外，本项目研究成果也为揭示肠上皮新型CaCC分子身份奠定了基础。