家蚕中肠特异启动子的构建及在抗病毒遗传改良中的应用

BmCPV and BmDNV only infect the midgut of silkworms, which cause severe economic losses to sericulture. The infection mechanisms of BmCPV and BmDNV and the immune defense mechanisms of host are unclear, RNAi of viral genes are the most effective strategy to inhibit the two viruses. BmAPN4 is a midgut-specific gene in silkworm, of which the promoter sequence was cloned and named the P3 promoter (P3P) in our previous study. Detection results showed that BmAPN4 was expressed in the entire midgut while P3P only had activity in the anterior midgut. Bioinformatics analysis revealed that there was a 5′UTR intron (5UI) between P3P and the translation start site ATG of BmAPN4, this 5UI may affect the expression of BmAPN4. In this project, we will clone the 5UI of BmAPN4 and study its function, construction of a specific promoter with activity in the entire silkworm midgut. And then, the dsRNA for multiple tandem genes of BmCPV would be controlled by this specific promoter to generate transgenic silkworms with resistance to BmCPV, and anti-BmDNV silkworms would be also generated by RNAi of viral multiple genes using this promoter. In conclusion, the implementation of this project will have an important reference value in basic research and applied research.

家蚕质型多角体病毒（BmCPV）和家蚕浓核病毒（BmDNV）只侵染家蚕中肠，给蚕业生产造成了严重经济损失。由于有关BmCPV和BmDNV侵染家蚕的机制以及蚕体的免疫防御机制都不甚清楚，干涉病毒基因是目前抑制这两种病毒最有效的策略。我们前期研究克隆了家蚕中肠特异表达基因BmAPN4的启动子序列，命名为P3启动子（P3P），检测结果显示BmAPN4在家蚕整个中肠表达而P3P只在中肠前部具有活性。生物信息学分析发现在P3P和BmAPN4的翻译起始位点ATG之间含有一个5′UTR内含子（5UI），推测其可能影响了BmAPN4的表达。本项目将克隆该5UI，对其功能进行研究并构建在家蚕整个中肠都有活性的特异启动子，进而利用该启动子介导BmCPV多个基因的串联干涉及BmDNV多个基因的串联干涉，制备抗BmCPV和抗BmDNV的转基因家蚕品系。本课题的实施将在基础研究和应用研究两方面都具有重要参考价值。

家蚕质型多角体病毒（BmCPV）和家蚕浓核病毒（BmDNV）只侵染家蚕中肠，给蚕业生产造成了严重经济损失，干涉病毒基因是目前抑制这两种病毒最有效的策略。. 首先鉴定了适合家蚕病毒研究的内参基因。查阅文献后选择Actin-1(A1)、A3、TIF-4A和GAPDH作为候选内参基因，根据病毒感染后的转录组数据和qPCR验证结果，确定TIF-4A可以作为家蚕病毒研究的内参基因。. BmCPV基因组由10条dsRNA（S1-10）组成。利用家蚕实用品种“芙蓉”，制备了同时干涉非结构蛋白编码基因S5、S8、S9、S10的转基因品系CNS和同时干涉S5、S8和结构蛋白编码基因S1、S2、S4的转基因品系SNS。感染高剂量BmCPV以后，CNS和SNS的死亡率分别比对照降低54%和50%，同时经济性状没有受到影响。. BmBDV基因组由两条线性单链DNA（VD1和VD2）组成，利用家蚕品种“大造”，制备了同时干涉VD1上4个ORF的转基因品系BDV1-I和同时干涉VD2上3个ORF的转基因品系BDV2-I。感染高剂量BmBDV以后，BDV1-I和BDV2-I的死亡率分别比对照降低45%和39%，同时经济性状没有受到影响。. 我们在前面研究中克隆两个家蚕中肠前部特异表达启动子P2P和P3P，本项目克隆了BmAPN4基因5′UTR内含子（5UI），构建P2P+5UI和P3P+5UI介导EGFP表达的转基因家蚕。通过荧光观察、RT-PCR和qPCR，发现BmAPN4的5UI能够影响P3P的表达位置和表达量，但对P2P没有影响；P3+5UI是一个在家蚕整个中肠都有活性的特异启动子。进而构建了P3P+5UI介导多个BmCPV基因和多个BmBDV基因串联干涉的转基因载体，显微注射家蚕“芙蓉”品种，筛选得到了转基因家蚕。. 本项目研究成果在基础研究和应用研究两方面都具有重要参考价值。