Nesprin在机械张应力诱导干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及信号转导机制研究

种子细胞来源困难是妨碍组织工程血管临床应用的重要原因。机械张应力诱导干细胞分化为血管平滑肌细胞，为解决该难题提供了新的手段。但机械应力也可诱导干细胞分化为其他细胞，因此寻找分化过程中的关键调控蛋白十分重要。Nesprin是一新发现的核膜信号蛋白家族，表达异常可导致肌细胞分化障碍，其作用机制不明。本课题拟以周期性张应力刺激小鼠骨髓间充质干细胞，诱导分化为血管平滑肌细胞，应用免疫印迹、免疫组化和基因敲出等方法，观察nesprin表达水平及在细胞内的定位分布的变化，研究nesprin表达和信号蛋白Rho及MAPK家族的相互作用关系，研究nesprin基因敲出对血管平滑肌细胞标志蛋白a-actin和SM MHC表达的影响。本课题研究nesprin在分化过程中的作用机制，可以回答nesprin蛋白功能的科学问题，而且为机械张应力诱导干细胞分化的调控提供新的靶点。

周期性张应力能诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞转化，应用RT-PCR及Western-blot检测了张力诱导前后血管平滑肌细胞标记物的表达变化，发现周期性张力能够明显上调血管平滑肌细胞标记物α-actin，calponin1， calponin3，SM-MHC的表达，w e s t e r n 发现张应力诱导n e s p r i n - 1 表达增强，免疫荧光显示n e s p r i n - 1 和n e s p r i n - 2 的分布为绕细胞核分布，Western-blot和免疫荧光检测n e s p r i n - 1 表达，周期性张力能够上调n e s p r i n - 1表达，伴随着TGF-β1的表达升高及ERK1/2通路的活化，将TGF-β1-siRNA转染入BMSCs，抑制TGF-β1表达，α-actin，calponin1， calponin3，SM-MHC表达明显降低，周期性张力诱导BMSCs向血管平滑肌细胞转化的作用消失，同时发现ERK1/2的磷酸化水平降低，说明TGF-β1可能是通过ERK1/2通路调控BMSCs向VSMC的转化。将siRNA转染入骨髓间充质干细胞，干扰nesprin1亚型的表达，western-blot检测α-actin，calponin1， calponin3，SM-MHC。发现周期性张力诱导的骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞转化作用降低，同时发现ERK1/2的磷酸化水平降低，说明nesprin-1可能是介导ERK1/2通路调控骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞的转化。siRNA干扰nesprin2表达无明显降低周期性张力诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞转化的作用。