人肠道病毒71型构象性中和表位的确定及其诱导抗病毒免疫保护应答机制研究

Enterovirus 71 (EV71) has become an important public health issue. Current progress on EV71 vaccine and our previous study suggest that conformational neutralizing epitopes on EV71 may be responsible for inducing protective immune response. However, the conformational neutralizing epitopes on EV71 are still not being identified. In this study, we will firstly use five different classes of anti-EV71 conformational monoclonal antibodies to map the potential amino acids constituted for the neutralizing epitope by using escape mutant analysis, molecular simulation and molecular docking methods. Secondly, we shall produce EV71 mutant viruses by reverse rescue of site specific mutated infectious clones and validate their amino acid alteration with EV71 positive human sera and EV71 newborn mouse model. Finally, we will determine the immune dominant epitope by using compete ELISA between EV71 positive human sera and five classes of anti-EV71 conformational monoclonal antibodies; and we will reveal the potential neutralizing mechanism by studying the interaction between EV71 viruses and their receptors. This study is expected to find the high avidity, broad-spectrum, dominant conformational epitope on EV71, define the structure characteristics of the EV71 conformational neutralizing epitopes, and clarify the mechanism of induce protective immune response; hence to provide scientific base for the development of vaccine and antiviral drug against EV71.

肠道病毒EV71是当前的重要公共卫生问题。EV71疫苗研究进展和我们的前期研究均提示EV71构象性中和表位在诱导机体免疫保护性应答中起重要作用，但EV71构象性中和表位目前未被清楚鉴定。本研究拟利用前期研究获得的五类EV71构象性中和单抗，先用逃逸突变分析方法和分子模拟对接预测方法初步鉴定出单抗识别的构象性中和表位的潜在氨基酸；然后，用定点突变和感染性克隆反向重组出突变型EV71病毒，再用EV71阳性病人血清和乳鼠保护模型分析各突变位点的有效性；最后，通过测定EV71阳性病人血清与单抗的竞争抑制效价以确定各中和表位的免疫优势性，通过检测单抗对病毒与受体相互作用的影响以确定各中和表位潜在的抗病毒机制。本研究有望发现EV71高亲和性、广谱、优势的构象性中和表位，明确定位EV71构象性中和表位的结构特征，阐明其诱导机体抗病毒免疫保护应答的机制，为研发EV71的疫苗和抗病毒药物提供科学依据。

本研究基于前期建立的EV71中和单抗库，应用分子模拟对接、抗体诱导逃逸突变和感染性克隆定点突变验证等方法揭示抗体中和表位的关键氨基酸组成，发现了EV71病毒的三个优势中和表位区，以及它们在不同EV71病毒颗粒类型中的结构特征，为EV71疫苗研发和质量控制研究提供理论基础；利用小鼠免疫血清和病人感染血清的竞争抑制ELISA分析三类中和抗体的免疫优势性，确定Site B是EV71的免疫优势中和表位区，为基于优势中和表位的疫苗设计提供了重要的理论基础；研究发现EV71的VP2存在一个高保守性的免疫优势中和表位，表位性质、结构特征、保护机制和表位疫苗展示研究，证明了该表位应用于疫苗和治疗的有效性；依托EV71研究技术平台，建立了检测CA16不同颗粒的ELISA方法，筛选出CA16中和抗体，通过逃逸突变方法鉴定出中和单抗识别的关键氨基酸，确定出两个CA16中和表位区的结构特征及免疫优势程度；基于上述优势中和表位的研究结果，利用感染性克隆和反向遗传学技术对EV71和CA16进行嵌合改造，证明了基于嵌合病毒的EV71/CA16二价疫苗在体内外实验中能够刺激产生针对EV71和CA16的保护性免疫，是一种有潜力新型手足口病二价疫苗。上述研究成果为进一步研究以EV71、CA16为代表的主要HFMD相关肠道病毒的中和表位与感染机制提供启示，为研制手足口病新型疫苗和抗病毒药物提供科学支持。研究期间还建立和完善了肠道病毒各项技术平台，建立了快速中和单抗筛选平台，成功应用于CA6和Echo25的中和抗体筛选和各种肠道病毒临床血清的检测研究，建立的多株肠道病毒感染性克隆和肠道病毒乳鼠感染模型，为后续开展肠道病毒感染机制、抗体中和机制、新型疫苗和治疗药物研究奠定了基础。