肠神经胶质细胞对肠平滑肌细胞的影响及其在炎症性肠病发病中的作用

The etiology and pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD) are still unclear. As reported from prior literature and our previous study, enteric nerve system (ENS) plays an important role in the pathogenesis of IBD. This project focuses on the effects of enteric glial cell (EGC) and its glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) on intestinal smooth muscle cell (ISMC) and its role on the pathogenesis of IBD. In animal experiment, ISMC agonist or antagonist were added to GDNF (+/-) heterozygous mice with GDNF partially knocked out or wild type mice treated with Ad-GDNF enema, to examine the effects of EGC and its GDNF on ISMC and its role in the pathogenesis of IBD. The effects of EGC on ISMC were investigated at a molecular level by culturing ISMC in EGC culture supernatant. Such methods as western blot were used to analyze the effects of GDNF/GFRa1/RET signaling pathway in the function of EGC and ISMC and the pathogenesis of IBD. This study contributes to illuminating the pathogenesis of IBD from the perspective of ENS and providing novel therapeutic strategies for IBD.

炎症性肠病（IBD）的病因和发病机制仍不清楚。文献及我们的前期研究证实肠神经系统（ENS）在IBD发病中起重要作用。本研究继续从ENS入手，但以肠神经胶质细胞（EGC）和肠平滑肌细胞（ISMC）为突破口。采用EGC培养上清液腹腔注射和GDNF（+/-）杂合子小鼠以及GDNF重组腺病毒灌肠野生Balc/C小鼠，造成EGC分泌增加和GDNF缺乏和/或增加的体内背景，并构建葡聚糖硫酸钠（DSS）及三硝基苯磺酸（TNBS）结肠炎模型，在此基础上使用ISMC的激动剂/拮抗剂，从动物水平探讨EGC及其分泌的GDNF对ISMC的影响以及在IBD发病中的作用；以EGC培养上清液体外培养ISMC，在细胞水平研究EGC对ISMC的影响；采用免疫印迹等技术从分子水平探讨GDNF/GFRa1/RET通路在两细胞功能发挥及IBD发病中的作用及机制。旨在从ENS角度阐明IBD的发病机制，为IBD防治奠定理论基础。

胶质细胞源性神经营养因子（GDNF)被证实在炎症性肠病（IBD）的发展过程中发挥重要作用。最新研究证实，除肠胶质细胞以外，肠平滑肌细胞在炎症条件下亦可产生大量GDNF。前期实验证实肠上皮细胞、肠胶质细胞及ISMC均可表达GDNF的受体RET及GFRα1，本研究探索肠平滑肌细胞来源的GDNF对肠上皮细胞屏障、肠胶质细胞存活及其自身表型转化的调节作用。首先，建立了含SV40LT基因的永生化肠平滑肌细胞系，并命名为ISMC-Hc，经免疫荧光染色证实其表达平滑肌标记物SMA及desmin。ISMC-Hc已稳定传代至50余代；卡巴胆碱作用后ISMC-Hc长轴长度有缩短，证实其仍保留一定的收缩特性；经睡美人转座系统转染荧光素酶报告基因后，小动物成像证实ISMC-Hc无成瘤特性。其次，炎症因子TNF-α刺激后，ISMC-Hc培养上清中GDNF含量明显增高，取上述含GDNF的细胞培养基培养大鼠肠上皮细胞系IEC-6及肠胶质细胞系EGC。结果显示，平滑肌来源的GDNF可抑制TNF-α所致的肠上皮屏障跨上皮电阻下降程度，增加ZO-1、E-cadherin、Occludin等连接蛋白的表达；平滑肌来源的GDNF促进EGC的增殖及对GFAP、S100β的表达。最后，过表达GDNF的ISMC-Hc进行转录组测序，结果表明差异基因共473个，其中上调的基因有331个，下调的基因有142个。GO富集分析显示差异基因的主要生物学功能有多个器官的发育、对病毒的反应、神经系统的形成、细胞间的粘附、细胞连接、解剖结构的形成等。KEGG分析揭示差异基因富集的主要通路有心肌病变、病毒性肝炎、肿瘤的形成等。进一步实验证实，过表达GDNF后其受体RET及 GFRα1表达量减少，过表达GDNF、敲减其受体RET或 GFRα1后，平滑肌细胞的增殖加速，而平滑肌细胞收缩相关蛋白a-SMA、SM22及calponin的表达均减低。综上所述，肠道炎症过程中，平滑肌源性的GDNF可能发挥双重作用。一方面抑制炎症所致的肠上皮细胞屏障的损害，对肠粘膜屏障发挥保护作用，另一方面促进肠胶质细胞的增殖，并通过GDNF-RET/GFRα1轴促进平滑肌自身的增殖，抑制自身收缩蛋白的表达，可能对肠道的运动功能产生消极影响。