药用植物抗帕金森病的活性成分筛选及作用机制研究

帕金森病已成为现代社会的常见病、高发病，严重地威胁着人们的身心健康，然而合成抗帕金森药物在治疗上有一定的局限性，且毒副作用较大，因此开发研究天然抗帕金森病药物具有重要的理论意义和实际应用价值。本项目在前期研究工作的基础上，采用梯度逆流色谱及高速逆流色谱等技术，对具有抗帕金森病作用的药用植物白芍、钩藤和川芎中化学成分进行分离提取，通过帕金森病细胞模型及动物模型试验对分离得到的组分及单体化合物进行活性评价研究。以具有抗帕金森病活性的组分或单体为研究对象，从细胞水平考察药物对MPP+致PC12细胞凋亡的保护作用及机制；从动物水平考察药物对MPTP所致帕金森病小鼠模型的神经保护作用及机制；同时采用荧光差异凝胶电泳（DIGE）和质谱（MS）技术对药物作用前后帕金森病细胞模型蛋白质水平的变化进行分析和鉴定，以研究帕金森病发病的分子机理以及药物作用机理等。

本项目通过四年的研究工作，已充分地完成项目计划内容。完成内容与项目申报书及任务书内容一致。在天然产物的分离提取方面，构建里动态超声波提取和离心分配色谱及高速逆流色谱联用技术，对白芍中苷类成分进行了分离提取，共分离得到4个化学成分；构建了循环超声波提取、高速逆流色谱和高效液相色谱联用技术，对钩藤中生物碱类成分进行了分离提取和在线的纯度检测，共分离得到3个纯度较高的生物碱。构建了循环超声波提取和高速逆流色谱、离心分配色谱联用技术，对川芎中内酯等成分进行了分离提取，共分离得到4个化学成分。此外，在项目的执行期内，构建了系列分离提取技术，对贯叶金丝桃中化学成分、红车轴草中异黄酮类成分、木瓜花瓣和玫瑰花中花色素类化学成分、三七和人参和西洋参中皂苷类成分进行了分离提取。在天然产物的活性评价方面，利用分光光度法检测PC12细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性、利用荧光分光光度法检测PC12细胞中Caspase-3活性变化、JC-1荧光标记法检测细胞线粒体膜电位水平、western blot检测Bcl-2，Bax蛋白表达变化、通过检测细胞内钙离子浓度、乳酸脱氢酶释放量等指标检测白芍、钩藤和川芎提取物及单体成分保护MPP+诱导的PC12细胞的原理。从细胞水平揭示药物作用机制。应用帕金森病动物模型，评价白芍、钩藤和川芎提取物抗帕金森病作用。对经PC12 细胞筛选出的有效组分及单体进行动物试验研究，进一步筛选抗帕金森病的有效组分及单体化合物。利用液质联用技术研究模型动物及给药模型动物脑组织内多巴胺（DA）及其代谢产物3，4-二轻基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）含量，5-轻色胺（5-HT）及其代谢产物5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）含量，从化学角度分析药物作用机理。利用白芍总苷提取物及芍药苷对MPTP致帕金森病小鼠损伤的caspase-12、caspase-9、Cytosolic cytochrome C、Bcl-2，Bax，BAD、p-AKT、AKT等蛋白表达水平的影响，从基因水平分析药物作用机理。.项目执行期内，共发表科技论文35篇，其中国际SCI收录29篇，中文核心期刊收录6篇。国际会议论文2篇，申请国家发明专利1项。培养博士研究生3名，硕士研究生9名，已经全部毕业。出版学术著作一部。获奖励4项，其中吉林省科技进步二等奖两项，吉林省自然科学学术成果奖一等奖和三等奖各一项。