HBV相关肝癌中microRNA-152参与的甲基化调控机制研究

在肝癌的发生、发展过程中，microRNA和DNA甲基化作为重要的表观遗传学调控环节发挥重要的作用。但是，目前对microRNA调控和DNA甲基化之间协同参与对肿瘤相关基因表达调控的网络尚不清晰。本研究在microRNA-152与DNA 甲基转移酶DNMT3A存在表达负相关性及潜在调控关系的研究基础上展开，拟进一步确证microRNA-152通过靶向抑制原癌基因转录因子c-fos从而对DNA甲基转移酶DNMT3A的间接调控作用，进而分析microRNA-152通过DNA甲基化途径参与肝癌发生的分子机制。该研究不仅有助于明晰microRNA-152通过直接和间接的双重途径影响DNA甲基化的机理，而且有助于阐明不同表观遗传学的分子相互影响和调节的作用网络，为肝癌的发生机制及寻找特异的肝癌治疗和预防的分子靶点奠定基础。

原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于所有癌症的第五位，严重威胁着人类健康。近年来发现表观遗传学异常在肿瘤的发生、发展过程中也起到非常重要的作用。HBV编码产生的HBx蛋白被认为与HCC的发生发展密切相关，可作为原癌基因或共作用因子促进肿瘤发生，最近的研究显示HBx还参与了肝癌发生中的表观遗传学调控。在本课题中，研究了在HBV相关性肝癌中是否存在着异常表达的能调控机体DNA甲基化状态的miRNAs，参与了肿瘤发生过程。本实验室前期研究中基于HBx转基因小鼠及对照野生型C57/BL6小鼠肝脏组织miRNA芯片发现miR152在HBx转基因小鼠肝脏组织中表达量发生明显下调。随后通过体外双荧光素酶报告基因检测证明miR-152可以通过直接与转录因子c-fos的3'-UTR区发生互补结合，从而靶向抑制其mRNA和蛋白表达水平，并通过DNMA3A间接调控机体的DNA甲基化状态。病人组织检测结果也显示miR152表达量在HBV相关性肝癌组织中比对应癌旁组织发生了显著下调，且miR152表达量与DNMT3A的mRNA表达负相关。细胞实验证明，细胞中过表达miR152可以导致基因组整体DNA甲基化水平（GDM）下降；相反，miR152抑制剂可导致细胞GDM上升，以及肿瘤抑制基因GSTP1和CDH1启动子区甲基化水平显著上升而抑制其表达，从而促进肿瘤发生。在本研究中，我们还从HBx转基因鼠角度入手，分析了HBV对 lncRNAs的表达影响，以及lncRNAs在HBV-HCC发生中的作用及分子机制。使用lncRNAs芯片技术筛选到一批在HBx转基因小鼠肝脏组织中比野生型小鼠发生显著差异的lncRNAs，并用实时定量PCR技术扩大样本量对它们在不同年龄和性别的转基因和野生型小鼠肝脏组织中的表达量进行了验证。证实HBx确实可影响机体lncRNAs表达，说明HBV感染者可能有其特异lncRNAs表达谱，且其中很多lncRNAs表达变异在感染的早期未发生肿瘤时就已经出现，提示它们的表达差异与肿瘤的发生密切相关。我们发现HBx诱导下调的一个lncRNA-AK050349，可以在体内外抑制肿瘤的增殖和迁移，在HBV相关性肝癌的发生起到抑癌基因的作用。AK050349可以通过与vimentin蛋白发生相互结合并抑制其表达，以及改变其正常的细胞骨架结构，发挥其抑制肿瘤转移的作用。